龟甲、鳖甲药材和饮片的DNA分子鉴定及动物药鉴定数据库的构建

发布时间：2020-11-02 03:11

　　 龟甲和鳖甲为临床常用动物类中药,龟甲为龟科动物乌龟的背甲及腹甲,具有滋阴潜阳、益肾强骨、养血补心、固经止崩等功效;鳖甲为鳖科动物鳖的背甲,具有滋阴潜阳、退热除蒸、软坚散结等功效。近年来由于需求量大、同名异物、民间用药差异、亲缘物种的形态学特征相似以及专业鉴定经验的缺乏等原因,市面上出现了一些龟甲与鳖甲的伪品,对临床用药的安全性和有效性造成了负面影响。虽然研究者开展了龟甲与鳖甲药材及原动物的鉴定研究工作,但对其饮片及掺伪品的鉴定尚未深入研究,应用范围较为局限。本论文根据龟甲与鳖甲及其常见伪品基原的线粒体全基因序列的差异设计了引物,并基于特异性扩增建立了一种专属性强、准确方便地鉴定龟甲与鳖甲药材和饮片的技术,可为监控市面产品的质量提供方法,有助于维护市场秩序,有利于保障临床用药的安全性与有效性,因而具有重要的应用价值,同时亦可为动物药的专属性鉴定提供一条新的途径。主要研究内容包括:1.首先根据全基因组序列的差异设计并筛选出了龟甲与鳖甲及三种常见伪品的5对特异性引物,继而采用SDS法、酚仿抽提法从新鲜龟甲与鳖甲中提取与纯化DNA,并通过改变PCR反应体系及扩增程序对PCR反应条件进行优化,在最优条件下进行特异性验证及灵敏度考察。结果显示,龟甲与鳖甲及其常见伪品巴西龟、花龟、佛罗里达鳖的DNA经扩增后分别在120 bp、120 bp、81 bp、105 bp、114 bp处产生条带,且未观察到引物间有交叉反应,体现出很强的专属性,可见所建立的特异性引物扩增技术可用于鉴定龟甲与鳖甲的真伪。另外,利用该方法时,五个物种的DNA的检出限均为1 ng,并且掺伪品中相应的基原物种均被准确检出。本章节的研究为此后龟甲与鳖甲的药材、饮片的鉴定研究奠定了基础。2.自制龟甲与鳖甲药材及生品,进而考察所建立的特异性引物扩增技术是否能够应用于鉴定这些药材及生品。此外,利用所建立的方法对市售的龟甲、鳖甲药材与生品进行鉴定,并依照判别标准对真伪、掺伪做出判断。结果显示,自制及市售药材与生品均扩增出与目的片段相一致的条带,可见采用该技术不仅可以成功地鉴定龟甲与鳖甲的原材料、药材,而且能够鉴定经过较长时间加热而制备得到的生品。3.自制龟甲与鳖甲醋制品,考察所建立的特异性引物扩增技术是否能够应用于鉴定经过深度加工的炮制品,并对市售醋龟甲和醋鳖甲进行鉴定。此后,利用荧光定量PCR进一步提高鉴定技术的检测灵敏度。结果表明,荧光定量PCR鉴定技术能够从全部自制醋龟甲与醋鳖甲中检出相应物种,检测效果明显优于常规PCR,但未能全部检出市售醋龟甲与醋鳖甲中的相应物种。与此同时,比较了不同试剂盒对炮制品DNA模板的提取与纯化效果,结果表明,三种试剂盒法均有利于制备具有高扩增效率的DNA模板,其中Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒效果最好,磁珠法微量基因组DNA抽提试剂盒次之。4.首先对动物药鉴定数据库进行了框架设计,进而利用Access对数据表进行栏目的设计以及数据的录入,以Visual Studio进行窗体的设计,并通过添加ADODC控件,在Visual Studio代码窗口中输入相应的代码将窗体与Access目标数据进行连接。最后,通过SQL语句实现动物药基本信息、特异性引物信息、样品信息的检索功能。最终初步构建了动物药鉴定数据库,有助于进一步开发网络共享平台,可为动物药的鉴定研究提供技术参数和数据支持,并为动物药的真伪辨识提供便利。
【学位单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R282.74;R284.1
【部分图文】：

第一章 绪论1.1 概述龟甲（Testudinis Carapax ET Plastrum，TCP）和鳖甲（Trionycis Carapax，TC）为临床常用动物类中药（图 1.1）。龟甲为龟科（Testudinidae）动物乌龟 Chinemys reevesii(Gray)（CR）的背甲及腹甲，其性微寒，味咸甘，归肝、肾、心经，具有滋阴潜阳、益肾强骨、养血补心、固经止崩等功效[1]。现代药理研究表明，龟甲具有增强免疫功能、抗缺血、抗凋亡、延缓衰老、解热镇静、兴奋子宫、促进骨髓间质干细胞增殖、抗帕金森病等作用[2]。鳖甲为鳖科（Trionychidae）动物鳖 Pelodiscus sinensis Wiegmann（PS）的背甲，其性微寒，味咸，归肝、肾经，具有滋阴潜阳、退热除蒸、软坚散结的功效[1]。现代药理研究表明，鳖甲具有抗肝纤维化、抗癌、治疗肺纤维化、增强免疫、降低血脂等作用[2]。

本论文的技术路线

体积的三氯甲烷-异戊醇（24:1），充分混匀，12000 rpm 离心 10 min 倍体积的 5 M 乙酸钾溶液和 2 倍体积的预冷 96%乙醇，充分混合，-2m 离心 15 mins，弃去废液；沉淀中加入预冷的 70%乙醇 500 μL 洗涤 15 mins，弃去废液；室温晾干，以 25 μL TE 缓冲液溶解，得到 DNA检查，4℃下保存，备用。异性引物的设计 CR（NC_006082.1、AY676201.1、FJ469674.1、KJ700438.1）、PS（NC_85.1、AY962573.1）及其常见伪品巴西龟 Trachemys scripta（TS）（NC_4.1、KM216749.1）、花龟 Mauremys sinensis（MS）（NC_016685.1、FJ50.1）和佛罗里达鳖 Apalone ferox（AF）（NC_014054.1、FJ890514.1用 Oligo 7 软件设计特异性引物，并通过 NCBI Primer-BLAST 评估，如表 2.4 所示，并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
【参考文献】

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本文编号：2866488