基于分子标记对化州柚及其近缘品系的分类鉴别研究

发布时间：2020-11-03 15:21

　　目的:化橘红来源于芸香科柑橘属植物化州柚(Citrus maxima‘Tomentosa’)或柚(Citrus maxima(Burm.)Merr.)及其栽培变种的未成熟或近成熟干燥外层果皮。化橘红具有化痰止咳、理气消积等功效,用治风寒咳嗽、久咳哮喘、呕吐呃逆等症。化橘红是我国长久以来用药筛选出的优质药品,是广东十大南药之一。其中来源于化州柚的毛橘红是传统的道地药材,在广东地区享有很高的声誉。毛橘红与来源于其它杂柚的光橘红市场价格差异极大,市场上的化橘红药材多来源于光橘红。而化橘红基原植物来源复杂异常,区分十分困难。传统的鉴别手段往往受限于植物生长年限、部位、环境等诸多因素,而分子标记的方法是基于植物内在遗传物质的差异进行鉴别,不易受这些因素的影响,且其结果较为可靠客观、准确。因此,采用分子标记手段对化州柚及其近缘品系植物进行研究,能够探讨不同品系的化州柚遗传背景以及与其它柚类的亲缘关系;有利于开发一种快速有效的鉴别方法,可以从苗期区分两者,为稳定苗木市场提供一种有力手段,同时也能为规范化橘红药材市场奠定一些基础。方法:本研究采用ITS2、psb A-trnH、matK三段DNA条形码序列在基因序列水平上对化州柚及其近缘品系共26份样品DNA进行研究,寻找合适于柚类植物分析的DNA条形码序列。利用SCoT标记和SRAP标记对26份试材DNA进行遗传聚类分析研究,并结合两者对比分析,对比多种分子标记手段在化州柚及其近缘品系植物研究中的效果。在SCoT标记和SRAP标记的基础上开发快速、直观的SCAR标记进行鉴别分析,以期为化橘红基原植物的鉴别提供一种快速、高效的鉴定方法。结果:1.应用3条国际通用DNA条形码对化州柚及其近缘品系进行研究,其中matK序列仅在外类群样品中得到1个碱基的变异,无法进行后续遗传聚类分析。ITS2序列虽然得到较高的变异率但聚类结果不理想,而psb A-trnH序列变异率较ITS2低,但取得的聚类结果更接近于真实情况,结合两种标记的分析结果则未优于psbA-trnH的聚类结果。但在总体上,DNA条形码序列在种下水平尤其是柚类植物的研究中,难以取得较好的效果。2.采用正交设计结合单因素法对SCoT-PCR反应体系进行优化,得到最终的优化结果为:3 mmol/L Mg~(2+)、0.3mmol/L dNTPs、0.75UTaq酶、0.6μmol/L引物、40ngDNA。通过引物筛选及退火温度优化,从36条引物中筛选出6条引物,在26份样品中扩增出了94条条带,平均多态性73.4%。利用UPGMA算法构建聚类树,对化州柚及其近缘品系进行分类鉴别研究。3.应用正交设计结合单因素法对SRAP-PCR反应体系优化,得到的最佳条件为:3 mmol/L Mg~(2+)、0.25 mmol/L dNTPs、0.75UTaq酶、0.4μmol/L每引物、40ngDNA。通过对110对引物组合的筛选,最终得到7对引物组合对所有样品进行分析,共扩增出84条条带,平均多态比率70.24%。其构建的聚类树与SCoT相似,但结果更为准确,结合两者标记构建聚类树,发现与SRAP构建的聚类树大致相同,但更为准确,表明SCoT标记和SRAP标记是适用于化州柚及其近缘品系植物分析的方法。对比SCoT、SRAP标记及两者结合的结果,mantel分析显示三种标记两两间的相似度高,表明SCoT标记和SRAP标记能够有效结合,其结果可靠、准确。4.在SCoT标记和SRAP标记的研究中发现3条特异性条带,对这3条条带进行回收、连接、转化、克隆、测序,获得3条条带的序列。对其重新设计引物,尝试转化为SCAR标记,最终在SCAR标记的验证中发现所有样品均出现了1条均一的条带,表明SCAR标记的转化失败。结合文献报道和实验,总结了几条可能导致失败的原因,以期为后来SCAR标记的开发奠定一定的基础。结论:3条国际通用DNA条形码序列在化州柚及其近缘品系的遗传关系研究中,未取得理想的效果,仅psbA-trn H序列的建树结果较好。SCoT标记的扩增效率和多态性较SRAP标记高,但在聚类分析中,SRAP标记取得了更接近真实情况的效果,结合两种标记分析,发现其能够完全区分化州柚及其它柚类。在基于SCoT标记和SRAP标记的基础上,开发SCAR标记,获得了3段特异序列,对其设计专有引物,但在最后验证的时候发现其多态性消失,转化失败。笔者根据实验结果,并参考了一些文献,总结了几点可能导致SCAR标记转化失败的原因,以期为后人的研究提供一些参考和借鉴。
【学位单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R282.5
【部分图文】：

序列,总DNA提取,样品,序列