尖叶假龙胆乙酸乙酯部位改善胰岛素抵抗作用机制研究及成分分析

发布时间：2020-11-03 19:19

　　 目的:探讨尖叶假龙胆乙酸乙酯部位改善IR-HepG2细胞胰岛素抵抗的作用机制,分析尖叶假龙胆乙酸乙酯部位化学成分,确保提供科学的药效物质基础,为中医药在临床上治疗糖尿病提供可靠稳定新药物及提升民族用药的价值。方法:1.采用乙醇及乙酸乙酯萃取方法制备尖叶假龙胆有效部位(乙酸乙酯部位);采用高胰岛素(10-6mol/L)刺激36h造模的方法,建立稳定可靠的IR-HepG2细胞模型:采用CCK8法筛选合适的药物浓度范围及检测HepG2细胞活性;以葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法测定IR-HepG2细胞葡萄糖消耗量;依照葡萄糖试剂盒测定葡萄糖消耗量的结果分组:正常组(Control组)、模型组(IR组)、尖叶假龙胆乙酸乙酯部位IR+50μg/mL组与IR+500 μg/mL组;采用Annexin V-FITC/PI双染法,给药24 h后,检测尖叶假龙胆乙酸乙酯部位对IR-HepG2细胞凋亡的影响;以酶联免疫吸附测定法,给药24 h后,考察尖叶假龙胆乙酸乙酯部位对IR-HepG2细胞的TNF-α的影响;给药24 h后,利用Real-time PCR 检测 IR-HepG2 细胞胰岛素信号通路 IRS1、PI3Kp85、PDK1、Akt mRNA的表达;给药30min后,以Western-Blot法检测IR-HepG2细胞胰岛素信号通路p-InsRβTyr1 135/1136、p-IRS1 ser307、p-PDK1 ser241、p-AktThr308 蛋白磷酸化水平的表达及PI3Kp85蛋白水平。2.采用高分辨液-质联用技术分析尖叶假龙胆乙酸乙酯部位化学成分;并通过HPLC-DAD高效液相色谱法,建立了同时测定尖叶假龙胆乙酸乙酯部位中去甲基雏菊叶龙胆酮、雏菊叶龙胆酮含量的方法,可为多指标成分测定质量控制提供参考。结果:1.筛选得到最佳模型条件:胰岛素浓度为10-6mol/L时,培养36h后,IR效果最佳,维持时间48 h;细胞毒性实验表明:尖叶假龙胆乙酸乙酯部位浓度为500μg/mL及低于此浓度时,细胞存活率达到实验要求;尖叶假龙胆乙酸乙酯部位浓度为500、250、100、50 μg/mL时,对IR-HepG2细胞模型有不同的程度促进葡萄糖消耗作用(P0.01),随着药物浓度的增大,降糖效果越好,药物浓度为500 μg/mL降糖效果与盐酸二甲双胍相当,浓度为10μg/mL时,未见其促进细胞葡萄糖消耗(P0.05);尖叶假龙胆乙酸乙酯部位对IR-HepG2细胞凋亡无影响;Elisa结果表明:与IR组相比,IR+50μg/mL组和IR+500 μg/mL组TNF-α表达水平呈现剂量依赖方式下降(P0.01),由此说明尖叶假龙胆乙酸乙酯部位能够下调TNF-α的水平;分子生物学实验表明:与IR 组相比,IR+50μg/mL 组和 IR+500 μg/mL 组均能上调 IRS1、PI3Kp85、PDK1、Akt mRNA的表达(P0.01或P0.05);与IR组相比,IR+50 μg/mL组和IR+500 μg/mL组均能上调p-InsRβ Tyr1135/1136、p-PDK1 ser241、p-Akt Thr308蛋白磷酸化水平(P0.01),下调p-IRS1 ser307蛋白磷酸化水平(P0.01),上调PI3Kp85蛋白水平(P0.05)。2.结合文献及对照品对照,共指认出尖叶假龙胆乙酸乙酯部位9个化合物,包括(?)酮类化合物4个(1,6-二四羟基-3,4-二甲氧基(?)酮、去甲基雏菊叶龙胆酮、swertiabisxanthone-I、雏菊叶龙胆酮),(?)酮苷类化合物3个(去甲基当药苷、当药醇苷、5,8-二羟基-1,4-二甲氧基(?)酮-3-O-β-D-葡萄糖苷),黄酮苷类化合物1个(异荭草素),三萜类化合物1个(齐墩果酸);建立了尖叶假龙胆乙酸乙酯部位同时测定去甲基雏菊叶龙胆酮和雏菊叶龙胆酮含量的方法,其含量分为 103.93 mg/g～106.33 mg/g 和 374.45 mg/g～379.22 mg/g。结论:尖叶假龙胆乙酸乙酯部位明显改善IR-HepG2细胞糖代谢及IR,促进糖消耗。其机制可能与调节胰岛素IRS/PI3K/Akt信号通路中的IRS1、PI3Kp85、PDK1、Akt基因表达,p-InsRβ Tyr1 135/1136、p-PDK1 ser241、p-Akt Thr308 蛋白磷酸化水平及 PI3Kp85蛋白水平相关。下调细胞因子TNF-α表达水平的作用,也可能是作用机制之一。尖叶假龙胆乙酸乙酯部位主要含有(?)酮及其苷类化合物,建立了同时测定两种成分含量测定的方法,对其主要成分含量进行测定。
【学位单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285;R284
【部分图文】：

ｑ＞Ｇ２细胞模型的建立??验结果表明，如图１－３所示，在不同浓度（１０＿９、１（Ｔ８、】０＇］０＇?ｌ（Ｔ５ｍｏｌ／激２４ｈ后，胰岛素浓度为１（Ｔ９、１（Ｔ７ｍｏｌ／Ｌ与Ｃｏｎｔｒｏｌ组相比，差异具有＜０．０。ＫＴ８、１０ｌＴ５ｍｏ

?尖叶假龙胆乙酸乙酯部位改善胰岛素抵抗作用机制研究及成分分析出，细胞总凋亡率在给药组与模型组及正常组之间没有显著性差异（Ｐ＞〇．〇５）。所以出，ＩＲ－ＨｅｐＧ２细胞用含尖叶假龙胆乙酸乙酯部位的培养基培养时，其对细胞无凋亡用。???Ｉ?ｔ?Ｉ???ＺＵ?Ｉ?Ｕ?Ｉ?Ｚ?Ｉ?Ｚ＇ｌｌｉｕｕｅｉ??

－，。??终止溶液５０＾Ｌ按照顺序加到每孔内，用于终止反应。??）用酶标仪在５?ｍｉｎ内，用４５０?ｎｍ波长按照号码测量各孔的ＯＤ值。??析方法??分析利用ＳＡＳ?８．２统计学软件进行分析，方差齐，两组间比较采用ＬＳ，两组间比较采用非参数检验；多组比较采用单因素方差分析，尸＜０．义，Ｐ＜０．０１有极显著统计学意义，实验数据以均数±标准差（）龙胆乙酸乙酯部位对ＩＲ－ＨｅｐＧ２细胞ＴＮＦ－ｏｔ的影响??１－９所示，与Ｃｏｎｔｒｏｌ组相比，ＩＲ组有较高水平的ＴＮＦ－ａ，差异具有（／＾Ｏ．Ｏｌ）；表明ＨｅｐＧ２细胞在高胰岛素刺激下产生炎症反应。与ＩＲｍＬ组和ＩＲ＋５０〇ｎｇ／ｍＬ组ＴＮＦ－ａ表达水平呈现剂量依赖方式下降，差学意义（尸＜〇．〇１）；由此说明尖叶假龙胆乙酸乙酯部位能够下调ＴＮＦ－１５０－??
【参考文献】

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本文编号：2868997