基于iTRAQ定量蛋白质组学技术的黄芩素抗耐药白念珠菌作用机制研究

发布时间：2020-11-06 00:41

　　 系统性白念珠菌感染病人日益增多,且病死率高达30%,天然耐药和获得性耐药为白念珠菌感染的治疗带来了巨大困难。临床上治疗侵袭性白念珠菌感染面临着药物种类少、耐药性强、副作用多的窘境,且抗真菌药物的研发进展十分缓慢,近十多年来未发现基于新靶点的抗耐药真菌新药。因此,研发高效、低毒的抗耐药真菌新药成为亟需解决的科学难题。本课题组前期从协同抗耐药白念珠菌的策略出发,发现了黄芩素等多个具有协同抗耐药白念珠菌活性的天然小分子化合物,并通过构效关系研究发现了它们共有的药效基团,但具体作用靶点和作用机制尚不明确。本研究拟采用基于iTRAQ的定量蛋白质组学技术结合前期实验结果研究活性化合物黄芩素作用白念珠菌细胞后特异性差异蛋白和作用靶点;采用基因敲除技术构建靶蛋白基因缺失菌,比较活性化合物作用基因缺失菌和野生菌后的表型差异,关联分析靶蛋白的生物学功能及深入研究活性化合物抗耐药白念珠菌的细胞和分子机制,为研究新型高效低毒的抗耐药真菌药物提供理论基础和实验依据。首先,在提取白念珠菌总蛋白实验中,我们以蛋白浓度稳定、SDS-PAGE电泳蛋白条带清晰均匀并结合iTRAQ实验对蛋白的要求为标准,探索总结了高质量提取白念珠菌总蛋白的实验体系。在iTRAQ实验中,我们成功筛选出氟康唑的靶蛋白ERG11,确证了iTRAQ技术筛选小分子药物作用靶蛋白的可行性。接着,我们筛选出黄芩素作用白念珠菌的差异蛋白共112种,其中重复差异蛋白16种。对差异蛋白进行GO分析和Pathway分析可知:差异蛋白的分子功能主要为:L-苹果酸脱氢酶活性、ATP结合、金属离子结合等;所在细胞位置主要为:细胞质、过氧化物酶体等;主要参与的生物过程为:三羧酸循环、脂肪酸β-氧化等。KEGG Pathway分析显示有14条可能相关的通路,主要为生物合成次生代谢物、抗生素碳、丙酮酸代谢等。然后,通过对16种重复差异蛋白的逐一分析,筛选出CPD2、SNQ2、CYS3、DBP2、PMA1、SLA2六个基因尝试基因敲除进一步考察其功能是否与黄芩素抗耐药白念珠菌作用相关。接着,我们采用HIS1-LEU2-ARG4基因敲除策略对上述六个基因尝试了基因敲除。其中,成功构建CPD2基因缺失菌及回复菌。表型考察实验表明,CPD2基因缺失后不影响白念珠菌的生长繁殖、菌丝形成、生物被膜形成和细胞表面疏水性,仅导致白念珠菌对H_2O_2、LiCl和卡泊芬净敏感性增加,对黄芩素、特比萘芬敏感性降低。小鼠系统性真菌感染生存率实验和肝、肾载菌量实验结果说明,CPD2基因缺失对白念珠菌的毒力无明显影响,但CPD2基因缺失后,白念珠菌对黄芩素的敏感性减低。体外药敏实验也表明:CPD2基因缺失后,白念珠菌对黄芩素的敏感性减低,基于以上结果,我们推断黄芩素发挥抗耐药白念珠菌的作用可能与CPD2基因功能相关。为研究黄芩素抗耐药白念珠菌作用机制,我们考察了黄芩素对药物转运蛋白外排功能的影响,诱导细胞凋亡的作用及与凋亡相关的一系列指标。罗丹明6G外排实验表明,CPD2基因缺失可能影响药物外排蛋白Mdr1p的功能或刺激MDR1基因的表达下调;黄芩素发挥抗真菌作用与药物转运蛋白无关;而氟康唑可刺激CDR1基因表达上调。细胞凋亡比例分析、Caspase酶活性实验、ROS检测实验及线粒体膜电位检测等一系列凋亡相关实验结果说明:黄芩素可能通过损伤线粒体的Caspase通路来诱导白念珠菌细胞凋亡,而CPD2基因缺失对黄芩素的这一功能具有抑制作用。综上所述,本课题基于iTRAQ定量蛋白质组学技术,筛选出小分子化合物黄芩素作用于白念珠菌后的表达上调蛋白Cpd2p,然后敲除了CPD2基因,通过表型考察及诱导凋亡相关机制研究,发现CPD2基因功能与黄芩素诱导白念珠菌细胞凋亡有关。
【学位单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
前言
第一部分 iTRAQ定量蛋白质组学技术检测药物作用后白念珠菌蛋白表达
    一.实验目的
    二.实验材料
        （一）菌株
        （二）试剂
        （三）仪器
        （四）试剂配制
        （五）药物
        （六）药物配制
    三.实验方法
        （一）菌株活化
        （二）白念珠菌总蛋白提取及鉴定
        （三）ITRAQ检测
        （四）RT-QPCR实验
    四.实验结果
        （一）白念珠菌总蛋白提取及鉴定
        （二）iTRAQ实验差异蛋白分析
        （三）RT-QPCR实验验证差异蛋白基因表达
    五.讨论
第二部分 差异蛋白基因缺失菌、回复菌构建及表型考察
    一.实验目的
    二.实验材料
        （一）动物
        （二）菌株
        （三）试剂
        （四）仪器
        （五）试剂配制
        （六）药物
    三.实验方法
        （一）融合片段构建及鉴定
        （二）目的基因敲除及鉴定
        （三）回复菌构建及鉴定
        （四）表型考察
    四.实验结果
        （一）菌株构建
        （二）CPD2Δ/Δ菌表型考察
    五.讨论
第三部分 黄芩素抗耐药白念珠菌的作用机制研究
    一.实验目的
    二.实验材料
        （一）菌株
        （二）试剂
        （三）仪器
        （四）试剂配制
        （五）药物
    三.实验方法
        （一）罗丹明6G外排实验
        （二）凋亡细胞、坏死细胞和活细胞比例分析
        （三）Caspase酶活性检测
        （四）细胞内活性氧ROS含量检测
        （五）线粒体膜电位测定
    四.实验结果
        （一）黄芩素、氟康唑对各菌罗丹明6G外排的影响
        （二）黄芩素诱导白念珠菌细胞发生凋亡
        （三）黄芩素诱导白念珠菌Casepase酶活性升高
        （四）黄芩素诱导白念珠菌细胞内ROS积累
        （五）黄芩素诱导白念珠菌线粒体膜电位降低
    五.讨论
总结
参考文献
综述
    参考文献
在读期间发表论文和参加科研工作说明
致谢

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 辛文妤;宋俊科;何国荣;杜冠华;;黄芩素和黄芩苷的药理作用及机制研究进展[J];中国新药杂志;2013年06期

本文编号：2872420