肾康注射液对UUO模型小鼠肾间质纤维化及内质网应激影响的研究

发布时间：2020-11-06 01:21

　　 目的:探讨肾康注射液对UUO模型小鼠肾间质纤维化的作用及其机制,为临床应用中医药防治肾间质纤维化提供科学依据与指导。方法:将60只雄性C57BL/6小鼠适应性喂养一周后,按体重随机分为两组,即Sham组(假手术组)10只,手术造模组50只。手术方法:假手术组小鼠在麻醉状态下开腹腔游离左侧输尿管,但不结扎;造模组小鼠在麻醉状态下行左侧输尿管结扎术。造模组小鼠在进行UUO造模后再随机分为五组:UUO组(模型组),ARB组(氯沙坦钾组)及H组(肾康注射液高剂量组)、M组(肾康注射液中剂量组)、L组(肾康注射液低剂量组),每组10只。术后第一天开始药物干预:sham组与UUO组予生理盐水(0.13ml/10g)尾静脉注射及生理盐水(0.15ml/]0g)灌胃;ARB组予生理盐水(0.13ml/10g)尾静脉注射及氯沙坦钾溶液(0.15ml/10g)灌胃;H组、M组及L组分别予高、中、低剂量肾康注射液0.13ml/10g尾静脉注射及生理盐水(0.15ml/10g)灌胃;连续给药14天。实验过程中观察记录小鼠的一般情况、体重等。第14天留取尿液,检测尿微量白蛋白(UALB)。给药结束后,摘眼球取血,测定血清肌酐(CREA)、尿素氮(BUN)、尿素(UA)、胱抑素C(Cys-c)水平;取肾组织,行HE、天狼星红染色观察肾组织病理形态变化;TUNEL染色法检测肾组织中的凋亡细胞;透射电镜观察肾小管上皮细胞内质网的变化;免疫组织化学法分析p-PERK、p-eIF2α、ATF4、CHOP、GRP78、caspase12、caspase3的蛋白表达。结果:1、血清学及尿液检测结果:与假手术组相比较,模型组小鼠血清肌酐(CREA)、尿素氮(BUN)、尿酸(UA)、胱抑素C(Cys-c)及尿微量白蛋白(UALB)未见明显变化(P0.05);与模型组比较,各治疗组上述指标亦未见显著变化(P0.05)。2、病理学观察结果:HE染色及天狼星红染色显示:假手术组小鼠患侧肾脏肾小球无明显的萎缩,肾小管排列紧密整齐,未见肾小管扩张及萎缩、炎细胞浸润等改变。胶原染色区域主要位于肾小球基底膜、系膜区和肾小管间的毛细血管周围,而肾小管周围间质范围较窄。模型组小鼠患侧肾脏组织可见大量的肾小管上皮细胞坏死、脱落,肾小管扩张、炎性细胞浸润,部分肾小球萎缩;肾间质纤维化范围显著扩大,胶原阳性染色程度明显增加;与假手术组相比,模型组小鼠患侧肾脏肾间质胶原阳性染色面积百分显著升高。与模型组相比,各治疗组小鼠患侧肾脏肾小管扩张、肾间质范围增加程度及间质胶原阳性染色程度均较模型组降低(P0.05),其中肾康注射液高剂量组较为明显。3、电镜观察结果:假手术组小鼠患侧肾脏肾小管上皮细胞内质网呈层叠管状结构,排列整齐,内质网膜上有少量核糖体附着,细胞核、线粒体等结构正常;模型组小鼠患侧肾脏肾小管上皮细胞内质网呈不同程度的肿胀,层叠管状结构改变甚至消失,内质网囊腔膨胀,扩大,有的呈空泡样结构,膜上附着的核糖体增多;细胞核肿胀,部分破裂;肾间质成纤维细胞增生。各治疗组小鼠患侧肾脏上述情况有不同程度的减轻;4、免疫组化检测结果:(1)假手术组小鼠患侧肾组织GRP78有少量表达;与假手术组相比,模型组小鼠患侧肾组织的GRP78的表达量显著增多(P0.05),以肾小管区域表达为主。与模型组相比,各治疗组小鼠患侧肾组织GRP78的表达显著减少(P0.05),其中以肾康注射液高、中剂量组较为明显;(2)假手术组小鼠患侧肾组织P-PERK、p-eIF2α、ATF4蛋白有少量表达、CHOP蛋白有极少量的表达。与假手术组相比,模型组小鼠患侧肾组织上述蛋白的表达明显增多(P0.05),范围以肾小管及其周围为主;与模型组相比,肾康注射液高、中、低剂量组及ARB组中,小鼠患侧肾组织P-PERK、p-eIF2α、CHOP蛋白的表达相对减少,差异具有统计学意义(P0.05);各治疗组小鼠患侧肾组织ATF4蛋白亦有减少,但差异不显著(P0.05)。各治疗组中,以肾康注射液高剂量组变化更为显著;(3)假手术组小鼠患侧肾组织caspase12、caspase3蛋白有少量的表达,与之相比,模型组小鼠患侧肾组织的上述蛋白的表达显著增多(P0.05);与模型组相比,各治疗组小鼠患侧肾组织caspase12、caspase3的表达明显减少(P0.05),其中以肾康注射液高剂量组效果更为明显。5、TUNEL检测:荧光显微镜下观察,sham组小鼠患侧肾凋亡细胞数量极少,呈散在分布;模型组小鼠患侧肾凋亡细胞数量明显增多,且主要位于肾小管区域;肾康注射液高、中、低剂量组及ARB组小鼠患侧肾凋亡细胞数量较模型组减少。结论:1、肾康注射液具有改善UUO模型小鼠肾间质纤维化的作用,并且高剂量时效果较为明显;2、UUO模型小鼠患侧肾脏细胞发生了内质网应激PERK-eIF2α-ATF4-CHOP通路介导的细胞凋亡,其下游可能与caspase12、caspase3等因子的激活有关;3、肾康注射液改善UUO模型小鼠肾间质纤维化的作用,其机制可能与下调内质网应激PERK-eIF2α-ATF4-CHOP通路及相关蛋白的表达,抑制细胞凋亡有关。
【学位单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R-332;R285.5
【部分图文】：

生［６１】。研究表明，ＣＨＯＰ介导细胞凋亡与激活ｃａｓｐａｓｅ有关，ＣＨＯＰ激活ｃａｓｐａｓｅ介导??的凋亡级联反应诱导肾脏细胞凋亡发生。肾小管上皮细胞持久或严重的发生内质网应??激，则可促进肾间质纤维化发生。（图１）??总之，肾间质纤维化本身极其复杂，涉及到多种病理生理过程，而肾脏固有细胞的??凋亡不仅会引起肾实质细胞减少，导致肾组织结构功能障碍，也是肾间质纤维化的促进??因素之一。从结构上或者功能上来说，肾脏具有ＥＲＳ发生的基础和条件，慢性肾脏疾??病极易发生ＥＲＳ，长期持续的诱导因素的刺激，内质网应激ＰＥＲＫ－ｅＩＦ２ａ＿ＡＴＦ４－ＣＨＯＰ??通路被激活，下游相关的凋亡因子被活化，从而诱导细胞凋亡，造成肾脏细胞大量凋亡??而肾功能明显减退。因此，深入研究ＥＲＳ介导的细胞凋亡与肾间质纤维化的关系，可??２４??

肾康注射液对ＵＵＯ模型小鼠肾间质纤维化及内质网应激影响的研宄表１各组小鼠体重变化（ｘ±ｓ，?ｎ＝１０）??组／时间?第０天?第３天?第７天?第１０天?第１５天??Ｓｈａｍ?２０．６?土０．６３?２２．２９土０．８６?２２．９９±０．９６?２２．８４士?１．１４?２２．４０±０．８４??ＵＵＯ?２１．１９±１．４２?２１．１８土?１．４５?２１．４５±１．５９?２１．３９土?１．８５?１９．５９±１．１１??ＡＲＢ?２０．９２ｉ０．８７?２０．８３±１．３４?１９．８２±１．８９?２０．０３土?１．７３?２０．２５土?１．１３??ＳＫＩ－Ｈ?２０．６８ｉ０．６１?２１．８３?士０．８０?２１．９０±０．５５?２２．２２士０．５９?２０．４７士?１．１４??ＳＫＩ－Ｍ?２０．７９ｉｌ．ｌｌ?２１．６２?土?１．２９?２０．６７士２．２６?２１．９０±１．１２?１９．９１?土?１．１０??ＳＫＩ－Ｌ?２１．２１?士０．５２?２１．６４士０．９８?２２．３２±０．９８?２２．７０±１．０９?２０．８０±０．９７??

模型组及各治疗组小鼠患侧肾脏颜色苍白，体积增大，外观肿胀呈囊性，内含大量浑浊??水液，肾重明显增加；切面可见肾孟、肾盏扩张，肾实质髓质萎缩分界模糊，上述表明??造模成功。（见
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本文编号：2872462