基于THP-1与MRC-5细胞模型的丹酚酸B与丹参酮ⅡA抗肺纤维化作用研究

发布时间：2020-11-11 14:17

　　 目的:肺纤维化(Pulmonary Fibrosis,PF)是一类以间质性炎症和肺间质纤维化为主要病变的间质性肺疾病。病理表现为细胞外基质过量沉积,临床表现为呼吸困难和正常肺功能丧失等。PF发病演变可分为氧化应激、肺泡炎和纤维化阶段。丹参主要含有水溶性的丹酚酸类和脂溶性的丹参酮类化合物,两类成分又分别以丹酚酸B和丹参酮ⅡA为代表。近年来,丹酚酸类和丹参酮类化合物的制剂在临床治疗PF显示出一定疗效。但目前的关于丹参抗PF的研究,通常仅选择丹酚酸类或者丹参酮类化合物中的一种成分来代表丹参进行研究,且只对PF演变的某一个过程进行研究,忽略丹酚酸类和丹参酮类成分之间的相互作用和PF发病过程的复杂性。因此本研究基于肺纤维化的形成机制,选择THP-1与MRC-5两种细胞模型,以及其共培养模型,对丹参中两类主要药效成分的代表化合物丹酚酸B和丹参酮ⅡA的抗肺纤维化作用机制及其协同作用进行研究,为丹参类制剂的临床应用及开发提供一定指导,也为其治疗PF提供理论依据。方法:(1)选用佛波酯(PMA)联合脂多糖(LPS),以细胞贴壁情况和细胞分泌的IL-1β含量为指标建立THP-1巨噬细胞炎症模型;采用实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)和酶联免疫吸附法(ELISA)检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)的mRNA表达量和蛋白分泌量,研究丹酚酸B与丹参酮ⅡA磺酸钠对炎症的影响。(2)选用转化生长因子-β1(TGF-β1),以细胞增殖为指标,建立MRC-5肺纤维化模型;采用CCK-8法检测丹酚酸B与丹参酮ⅡA磺酸钠对TGF-β1诱导的MRC-5细胞增殖的影响;采用免疫荧光法定性检测α-SMA蛋白;采用qRT-PCR法和western blot法检测α-SMA、纤维连接蛋白(FN)和Ⅰ型胶原α1(COL1α1)mRNA和蛋白的相对的表达量,研究丹酚酸B与丹参酮ⅡA磺酸钠对肺纤维化的影响。(3)利用Transwell小室将两种细胞共同培养,加入LPS刺激,以细胞形态变化为依据,初步建立THP-1巨噬细胞和MRC-5细胞的共培养模型,采用qRT-PCR法检测MRC-5细胞α-SMA的mRNA相对表达量,揭示丹参两类成分对于PF多途径作用的机制。结果:(1)丹酚酸B与丹参酮ⅡA磺酸钠对THP-1巨噬细胞炎症模型影响的结果表明:100 ng/mL的PMA作用THP-1细胞48 h,可以诱导其从悬浮细胞变为贴壁的THP-1巨噬细胞。静息24 h后,再联合0.5μg/mL的LPS作用24 h可以建立高表达IL-1β的THP-1巨噬细胞炎症模型。ELISA和qRT-PCR结果表明:丹酚酸B和丹参酮ⅡA磺酸钠不仅能从mRNA水平降低炎症模型IL-1β和TNF-α的相对表达量(P0.05),还能从蛋白水平降低炎症模型细胞分泌的IL-1β和TNF-α蛋白量。并从合用组的数据可以初步推测,两类成分在抗炎方面可能不具有协同作用。(2)丹酚酸B与丹参酮ⅡA磺酸钠对MRC-5肺纤维化细胞模型影响的结果表明:10 ng/mL的TGF-β1作用48 h可使MRC-5增殖加快(P0.05),且上调肺纤维化标志物α-SMA、FN和COL1α1蛋白与mRNA水平,可建立MRC-5肺纤维化模型。免疫荧光结果显示:α-SMA蛋白在各组细胞中均有表达,且在细胞质和细胞核中均有分布。蛋白免疫印迹结果显示:合用组能显著降低α-SMA蛋白的相对表达量(P0.05),而单独用药组不能;除丹酚酸B组外,阳性药组、丹参酮ⅡA磺酸钠组和合用组能显著减低COL1α1蛋白的相对表达量(P0.05);除单独用药组外,阳性药组和合用组也能显著降低FN蛋白的相对表达量(P0.05)。qRT-PCR结果显示:丹参的两类主要成分和作为TGF-β1抑制剂的SB431542都可以显著模型组降低α-SMA、FN和COL1α1的mRNA相对表达量(P0.05)。并从合用组的数据可以初步推测,两类成分在抗肺纤维化方面可能具有协同作用。(3)丹酚酸B与丹参酮ⅡA对共培养肺纤维化模型影响的结果表明:先用100 ng/mL的PMA作用于THP-1细胞48 h得到THP-1巨噬细胞,再用Transwell小室将THP-1巨噬细胞和MRC-5细胞共同适应性培养24 h,之后加入0.5μg/mL的LPS诱导48 h,MRC-5细胞形态发生了变化,提示MRC-5细胞发生了转分化。qRT-PCR结果显示:地塞米松组、丹酚酸B组、丹参酮ⅡA磺酸钠组和二者合用组的MRC-5细胞α-SMA相对mRNA表达量显著降低(P0.05)。提示丹酚酸B和丹参酮ⅡA磺酸钠对于肺纤维化有较好的抑制作用,且抑制炎症能一定程度上抑制肺纤维化进程。结论:丹酚酸B、丹参酮ⅡA磺酸钠以及二者合用对于M1经典活化巨噬细胞炎症模型和TGF-β1诱导的MRC-5肺纤维化模型都有较好的抑制作用,具有抗炎和抗肺纤维化的活性,能通过多个途径作用于PF,发挥治疗作用。丹参的两类主要成分丹酚酸B和丹参酮ⅡA在抗炎方面未见协同作用,但在抗纤维化方面体现出一定的协同作用。
【学位单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

丹参的主要活性成分主要分为两大类,一类是水溶性成分,一类是脂溶性成分。至今发现的水溶性成分多达20余种,主要为酚酸类化合物,因此也被称为丹参多酚酸。其中以丹酚酸B药理活性最强,是丹参水溶性成分的代表[39]。除了丹酚酸B,丹参水溶性成分中活性较强的还有丹参素、丹参酚酸A和迷迭香酸等成分[40]。大部分丹参多酚酸的基本结构单元是丹参素,又名D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)乳酸,是最早发现的水溶性成分[41]。丹酚酸B由三分子丹参素与一分子咖啡酸缩合而成[42],CAS号为115939-25-8,分子式为C36H30O16,分子量为718.6138,具体结构式见图1。目前发现的脂溶性成分多达50余种,多为二萜醌类化合物,其中以丹参酮类化合物含量最高[43]。丹参酮ⅡA作为丹参脂溶性成分中含量最多的单体成分,是丹参脂溶性成分的代表。除此以外,丹参的脂溶性活性成分还包括丹参酮Ⅰ、隐丹参酮和二氢丹参酮Ⅰ等。丹参酮ⅡA,CAS号为568-72-9,分子式为C19H20O3,分子量296.3603,具体结构式见图2。图2 丹参酮ⅡA化学结构式

图1 丹酚酸B化学结构式两类成分在体内的代谢反应不尽相同。水溶性成分主要发生甲基化和葡萄糖醛酸化等Ⅱ相代谢反应。脂溶性成分,则主要发生脱氢,羟基化、呋喃环裂解和氧化等Ⅰ相代谢反应[44]。因此,在应用丹参治疗疾病时,应综合考虑丹参两类成分的功效和代谢特点,发挥其最大的优势。

Transwell小室构造
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本文编号：2879298