TLR4-MyD88信号转导途径介导黄芪多糖免疫调节的机制研究

发布时间：2020-11-13 03:21

　　 目的:研究黄芪多糖(Astragalus polysaccharides,APS)对RAW264.7小鼠源性巨噬细胞和EAC荷瘤小鼠的免疫调节作用,以及APS对TLR4信号转导途径的调节机制。方法:体外培养RAW264.7小鼠源性巨噬细胞经APS刺激处理后,收集细胞上清液,Griess法和ELISA法分别检测上清液中NO、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-12p70的浓度;提取细胞总mRNA和总蛋白,qRT-PCR和Western Blots检测TLR4信号通路相关节点基因和蛋白的表达变化。在阻断剂组加入TAK-242或ST-2825预处理细胞后加入APS,ELISA法检测上清液中TNF-α和IL-6表达的变化。采用正常对照组(C57BL/10J和C57BL/6J)和基因缺陷型(C57BL/10ScNJ TLR4缺陷和C57BL/B6.129P2(SJL)-Myd88m1.1Defr/J MyD88缺陷)小鼠构建EAC荷瘤小鼠乳腺癌动物模型,分为生理盐水组、阿霉素(ADM)组、APS组和LPS组,处理25天后,经颈椎脱臼法处死小鼠,收集小鼠眼球血应用ELISA法检测细胞因子;取实体瘤、脾脏和胸腺,称重后统计瘤重和脏器指数,流式细胞术检测肿瘤组织细胞凋亡率。qRT-PCR和Western Blots检测脾脏组织中TLR4信号通路相关节点基因和蛋白的表达情况。结果:APS显著促进巨噬细胞NO、TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌(P0.05),对IL-12p70无显著作用(P0.05)。巨噬细胞在阻断剂TAK-242和ST-2825的干预下,APS对NO及细胞因子分泌的促进作用显著降低(P0.05)。在正常对照组荷瘤小鼠中,APS显著促进肿瘤细胞凋亡率、脏器指数和外周血中细胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)的分泌,减低瘤重(P0.05),对外周血中IL-12p70的分泌无显著作用(P0.05)。qRT-PCR和Western Blots结果显示,APS在体外巨噬细胞和正常对照组的荷瘤小鼠中均可以显著刺激TLR4、MyD88、TRAF-6、NF-κB和AP-1的表达(P0.05),对TRAM的表达无显著作用(P0.05)。在基因缺陷型荷瘤小鼠中,APS对瘤重、肿瘤凋亡率、脏器指数及细胞因子均无显著作用,TLR4信号通路下游相关节点表达无明显变化(P0.05)。结论:TLR4-MyD88依赖信号转导通路可能是APS发挥免疫调节作用的信号转导途径之一。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

因素方差分析和独立样本 t-检验等方法分析。结果异有统计学意义。AW264.7 巨噬细胞一氧化氮（NO）分泌水平 鼠源性巨噬细胞株在体外培养的环境下，观察黄芪将处于对数期的 RAW264.7 细胞分为阴性对照组、。体外培养不同时间点之后，分别收集 4h、8h、1时间点的上清液，用 Griess 法检测细胞上清液中一显示（如图 1.1 所示），与阴性对照组相比，APS 的分泌(P<0.05)，并且呈时间依赖性；在 16h 到 24

图 1.3APS 对 TLR4 信号转导通路关键节点基因及蛋白表达水平的影响Fig. 1.3 Effects of APS on TLR4 signaling pathway in RAW 264.7 cells.* P<0.05 vs. Control group.2.4 特异性分子阻断剂反向验证 APS 对细胞中 TLR4 通路的作用体外培养 RAW264.7 巨噬细胞，如方法部分 1.2.6 所述，提前孵育 TAK-242（TLR4 特异性阻断剂）或 ST-2825（MyD88 分子阻断剂），各组经过处理后收集细胞上清液，ELISA 检测上清液中 IL-6 和 TNF-α 的分泌情况。结果显示：在未加阻断剂组中，与 Control 组相比，APS 可以显著促进 RAW264.7 巨噬细胞分泌 IL-6和 TNF-α 的分泌（P<0.05）；在两个阻断剂组（TAK-242 组和 ST-2825 组）中，APS 组与 Control 组的两种细胞因子水平并无显著差异（P>0.05）。此外，在两个阻断剂组中，APS 组的两种细胞因子均显著低于未加阻断剂组的 APS 组（P<0.05）。

图 1.4、APS 对 RAW264.7 巨噬细胞细胞因子分泌水平的影响Fig. 1.4. Effects of APS on the cytokines secresion of RAW 264.7 cells.The reported values are the mean±SD, n=3. *, P<0.05, ** P<0.01. #, P<0.05, ## P<0.01.3 讨论经大量研究证实，黄芪多糖（APS）具有多种免疫调节的功效。APS 可以抑制CD4+CD25+调理型 T 细胞增殖[10]，促进树突状细胞分化成熟[6]，调节 Th1/Th2 细胞亚群的免疫失衡，调节红细胞系的成熟分化[11, 12]以及增加巨噬细胞的吞噬活性[12]。巨噬细胞作为特异性抗原提呈细胞，通过吞噬病原体、处理提呈抗原和释放活性介质参与抗感染抗肿瘤非特异性免疫防御，对机体的免疫系统起到重要的调节作用[13-15]。激活巨噬细胞发挥免疫调节和杀死肿瘤细胞及病原体的方式主要有
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本文编号：2881649