芪参汤通过细胞自噬对肝窦内皮细胞去分化的影响

发布时间：2020-11-13 22:03

【摘要】：目的:观察芪参汤对肝窦内皮细胞去分化及自噬的影响。方法:大鼠肝窦内皮细胞(LSEC)随机分为空白组、模型组、芪参汤低、中、高和抑制剂组,通过100μg/mL的氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)诱导24 h建模并给予相应的药物或血清进行干预。分别采用RT-qPCR及免疫荧光染色法检测VEGFR2及ET1的表达水平,透射电镜检测LSEC超微结构,ELISA法检测NO含量,Western blot法检测自噬相关蛋白(LC3BI、LC3BII和p62)及内皮细胞功能相关蛋白(eNOS及其磷酸化水平)的表达水平。结果:透射电镜结果显示,芪参汤含药血清能增加LSEC细胞中窗孔、自噬体的数量,抑制内皮下基底膜形成。与模型组相比,芪参汤含药血清能够明显上调LSEC中VEGFR2 mRNA及蛋白的表达水平,下调ET1 mRNA及蛋白的表达水平,差异均具有统计学意义(P0.05)。此外,芪参汤还能明显增加LSEC中LC3BⅡ、p-eNOS、eNOS蛋白的表达和LC3BⅡ/LC3BI、p-eNOS/eNOS比值,降低LC3BI和p62蛋白的表达,与模型组比较,差异均具有统计学意义(P0.05)。结论:芪参汤能够通过促进LSEC自噬水平抑制其去分化水平,进而发挥抗肝纤维化的作用。
【图文】：

透射电镜结果显示,空白组LSEC细胞中可见大量窗孔,内皮下未见基底膜形成,同时可见少量自噬体。oxLDL能够明显减少LSEC细胞中窗孔及自噬体的数量,同时局部内皮下可见连续基底膜。芪参汤各剂量组均能增加LSEC细胞中窗孔、自噬体的数量,抑制内皮下基底膜形成,并且呈现浓度依赖的方式。与模型组相比,抑制剂组中LSEC细胞中窗孔及自噬体的数量明显增加,同时局部内皮下可见连续基底膜。见图1。2.2 芪参汤对LSEC中VEGFR2及ET1 mRNA及蛋白表达的影响

100 μg/mL oxLDL能够明显降低LSEC中VEGFR2 mRNA及蛋白的表达水平,上调ET1 mRNA及蛋白的表达水平,进而促进LSEC从分化型向去分化型的转化,与空白组比较,差异均具有统计学意义(P<0.05)。芪参汤各浓度含药血清均能显著上调LSEC中VEGFR2 mRNA及蛋白的表达水平,下调ET1 mRNA及蛋白的表达水平,进而逆转LSEC的去分化,与模型组比较,差异均具有统计学意义(P<0.05)。作为自噬抑制剂的氯喹与oxLDL作用相同,能够显著降低LSEC中VEGFR2 mRNA及蛋白的表达水平,上调ET1 mRNA及蛋白的表达水平,加重LSEC从分化型向去分化型的转化,与模型组比较,差异均具有统计学意义(P<0.05)。见表1、2和图2。表1 各组LSEC中VEGFR2及ET1 mRNA表达的比较 (n=3, x ˉ ±s) Tab 1 Comparison of VEGFR2 and ET1 mRNA expression in LSEC of each group (n=3, x ˉ ±s) 组别 药物浓度 VEGFR2 mRNA ET1 mRNA 空白组 不含药血清 1.00±0.01 1.00±0.02 模型组 不含药血清 0.34±0.08* 2.78±0.33* 低剂量组 4.23 g/kg芪参汤 0.45±0.11# 2.19±0.24# 中剂量组 8.46 g/kg芪参汤 0.57±0.09# 1.85±0.16# 高剂量组 16.92 g/kg芪参汤 0.93±0.17# 1.32±0.15# 抑制剂组 不含药血清+20 μmol氯喹 0.22±0.05# 3.41±0.41# 注:与空白组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05。

与空白组相比,模型组中LC3BⅡ、p-eNOS、eNOS蛋白的表达和LC3BⅡ/LC3BI、p-eNOS/eNOS比值明显降低,LC3BI和p62蛋白的表达显著增加,差异均具有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比,芪参汤中、高剂量均能明显增加LSEC中LC3BⅡ、p-eNOS、eNOS蛋白的表达和LC3BⅡ/LC3BI、p-eNOS/eNOS比值,降低LC3BI和p62蛋白的表达,差异均具有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比,氯喹能够增加LC3BⅡ/LC3BI的比值和p62蛋白的表达,降低p-eNOS、eNOS蛋白的表达和p-eNOS/eNOS比值,差异均具有统计学意义(P<0.05)。见表4、5和图3。表4 各组LSEC中自噬标记蛋白表达的比较 (n=3, x ˉ ±s) Tab 4 Comparison of autophagy marker protein expression in LSEC of each group (n=3, x ˉ ±s) 组别 LC3BⅡ/β-actin LC3BI/β-actin LC3BⅡ/LC3BI p62/β-actin 空白组 0.22±0.03 0.31±0.04 0.65±0.15 0.23±0.04 模型组 0.12±0.02* 0.42±0.06* 0.25±0.07* 0.53±0.09* 低剂量组 0.15±0.03 0.40±0.05 0.28±0.05 0.42±0.12 中剂量组 0.20±0.04# 0.33±0.04# 0.60±0.11# 0.31±0.07# 高剂量组 0.31±0.06# 0.21±0.03# 1.42±0.21# 0.21±0.05# 抑制剂组 0.19±0.03 0.42±0.05 0.51±0.09# 0.81±0.16# 注:与空白组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05。
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