基于“补肝肾、强筋骨”临床功效的牛膝质量评价和活性部位实验研究

发布时间：2020-11-15 17:19

　　 目的:建立多指标同时测定牛膝的甾酮类和皂苷类化学成分的定量方法;多指标正交试验优选牛膝酒炙工艺;观察牛膝甾酮皂苷化学部位和牛膝多糖抗软骨细胞凋亡作用,多糖、甾酮皂苷化学部位配伍使用能否增效。有关实验研究丰富牛膝质控方法,为牛膝的酒炙饮片加工提供合理的技术参数,为牛膝的深入研发提供理论基础。方法:1.查阅文献资料、开展预试验,从β-蜕皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮、人参皂苷Ro、牛膝皂苷Ⅱ、竹节参皂苷Ⅳa和胡萝卜苷中确定β-蜕皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮、人参皂苷Ro和竹节参皂苷Ⅳa为牛膝单体成分含量测定的指标性成分;采用HPLC法,Agilent ZORBAX SB-C_(18)色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);以乙腈(A)-0.5%磷酸溶液(B)为流动相,梯度洗脱(0~18min,17%A;18~20min,17%A→32%A;20~64min,32%A;64~65min,32%A→17%A);同时测定牛膝中β-蜕皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮、人参皂苷Ro和竹节参皂苷Ⅳa的含量,检测波长β-蜕皮甾酮、25R-牛膝甾酮和25S-牛膝甾酮250nm,人参皂苷Ro和竹节参皂苷Ⅳa 203nm;并进行相应的方法学考察。2.总甾酮以β-蜕皮甾酮为对照,采用UV法242nm波长下测定总甾酮含量;总皂苷以人参皂苷Ro为对照,香草醛-冰醋酸-高氯酸反应显色处理,采用UV法544nm波长下测定总皂苷含量;总多糖以葡萄糖为对照品,苯酚-浓硫酸反应显色处理,采用UV法584nm波长下测定总皂苷含量。3.选取酒种类、加酒量、闷润时间3个考察因素,每个因素设定3个水平,采用L_9(3~4)进行正交设计,以β-蜕皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮、人参皂苷Ro、竹节参皂苷Ⅳa、总甾酮、总皂苷和总多糖为指标,综合优选牛膝的最佳酒炙工艺。4.按中国药典2015年版一部牛膝项下有关规定,制备牛膝段、酒牛膝饮片,比较牛膝药材、牛膝段、酒牛膝中甾酮类、皂苷类和多糖类成分的含量变化情况。5.根据牛膝中甾酮、皂苷和多糖的理化性质,乙醇溶液提取,大孔吸附树脂纯化,制备牛膝总甾酮皂苷化学部位;醇提后的药渣加水煎煮,乙醇分级沉淀制备牛膝总多糖,多指标控制牛膝总甾酮皂苷、总多糖化学部位的质量。6.大鼠灌胃7天后腹主动脉取血,制备含药血清;培养C28/I2软骨细胞系,优化细胞铺板数、硝普钠造模浓度;分别加入体积分数5%、10%、15%的甾酮皂苷和多糖化学部位含药血清与硝普钠共培养24、48、72小时,确定药物活性、给药浓度和时间;5%以下不同浓度甾酮皂苷、多糖含药血清配比组合,与硝普钠共培养24小时,确定增效活性及药物浓度配比;MTT法检测细胞增殖活性。结果:1.建立了HPLC法同时测定牛膝及其炮制品中β-蜕皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮等3个甾酮类成分和人参皂苷Ro、竹节参皂苷Ⅳa等2个皂苷类成分含量的方法,所建立的方法重现性好、准确率高。β-蜕皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮、人参皂苷Ro和竹节参皂苷Ⅳa进样量分别在0.2180~2.7250μg(r=0.9998)、0.0796~0.9950μg(r=0.9999)、0.1548~1.9350μg(r=0.9999)、0.3520~4.4000μg(r=0.9998)和0.3380~4.2250μg(r=0.9998)范围内呈良好的线性关系;加样回收率分别为98.37%、101.66%、99.09%、99.25%和101.53%,相应的RSD分别为0.87%、1.02%、1.74%、0.67%和1.28%。2.实验中建立的牛膝总甾酮、总皂苷含量测定的方法,准确、简便,分别在0.0260~0.0940mg/mL(r=0.9992)、0.0090~0.0990mg(r=0.9980)范围内呈良好的线性关系,平均加样回收率分别为98.85%、99.32%,RSD值分别为为1.89%、1.17%。建立的总多糖含量测定方法,简便、易行,在0.0024~0.0289mg/mL(r=0.9994)范围内线性关系良好。3.优选出的牛膝最佳酒炙工艺为牛膝段加10%(g/g)黄酒闷润60min后炒炙15min,工艺验证表明该工艺简便、易于控制、重复性良好。4.与牛膝药材相比较,牛膝段饮片中甾酮类单体成分、总甾酮、总多糖的含量略有下降,而皂苷类单体成分、总皂苷的含量则明显降低;与牛膝段相比较,牛膝酒炙后,甾酮类成分含量略有增加,人参皂苷Ro和总皂苷的含量出现较为明显的增加;总多糖含量下降明显。5.制得的三批次甾酮皂苷化学部位和多糖化学部位中5个单体成分和3种总成分的含量基本稳定。本实验所用制备牛膝甾酮皂苷化学部位、多糖化学部位的提取方法简便可行,质量稳定。6.C28/I2细胞最佳损伤模型条件为铺板数15×10~3个/孔,硝普钠1mmol/L培养24小时,与模型组相比,牛膝甾酮皂苷、多糖含药血清均显著提高细胞增殖活性(P0.05);以牛膝甾酮皂苷含药血清为基础,配伍牛膝多糖,能显著提高细胞增殖活性(P0.05),多糖-甾酮皂苷含药血清最佳配比1.25%-5%。结论:本文建立了HPLC法同时测定牛膝及其炮制品中β-蜕皮甾酮、25R-牛膝甾酮和25S-牛膝甾酮3个甾酮类成分、人参皂苷Ro和竹节参皂苷Ⅳa2个皂苷类成分的方法,UV法测定总甾酮、总皂苷和总多糖的方法,经方法学考察以上方法均简单、准确、有良好的稳定性和重复性,可用于牛膝及其复方制剂的质量评价;优选出酒牛膝的最佳炮制工艺,简便、易于控制、重复性良好;牛膝甾酮皂苷化学部位和多糖均具有抗软骨细胞凋亡的作用,且两者配伍增效明显。
【学位单位】：河南中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285.5;R284
【部分图文】：

取上述牛膝段和酒牛膝样品，分别粉碎成细粉，按第一部分“2.3.2”项下制备单体成分含量测定的供试品溶液，分别按第二部分“2.1.1”、“2.1.1”、“2.3.1备总甾酮、总皂苷、总多糖含量测定供试品溶液。按第一部分“2.1.6”项下色谱测定 5 种单体成分含量，分别按第二部分“2.1.4”、“2.2.3”、“2.3.4”项下测法测定总甾酮、总皂苷、总多糖的含量。牛膝药材、牛膝段、酒牛膝 5 种单体成 3 种总成分含量测定结果如表 4-1，牛膝及其炮制品各成分含量比较见柱状图 4-1-2，HPLC 色谱图见附图 4-1。表 4-1 牛膝、牛膝段和酒牛膝的含量测定结果（n=3，%）编号 β-蜕皮甾酮/%25R-牛膝甾酮/%25S-牛膝甾酮/%人参皂苷 Ro/%竹节参皂苷Ⅳ a/%总甾酮/%总皂苷/%总多/%药材0.0626 0.0150 0.0235 0.0833 0.0424 0.4101 1.5756 10.81膝段 0.0561 0.0122 0.0226 0.0580 0.02560.36021.344810.52牛膝 0.0565 0.0136 0.0228 0.0638 0.02540.3913 1.6569 7.189

图 4-2 牛膝及其炮制品 3 个总成分含量柱状图附图 3-1 可以看出，牛膝药材呈细长圆柱形，有时稍弯曲，上端较粗，约 15～70cm，直径约 0.4～1cm，表面呈灰黄色或淡棕色，具细微的纵皱根痕；牛膝段为圆柱形 5～10mm 的短段，外表皮灰黄色或淡棕色，有微横长皮孔，切面平坦，淡棕色或棕色，略呈角质样而油润，中心维管束白色，其外围散有多数黄白色点状维管束，断续排列成 2～4 轮；酒牛膝大小相似，表面色略深，偶见焦斑，切面皮部略有膨大，筋脉点不明显。膝药材制成牛膝段的过程中重量变化较小，损失部分主要是芦头的重量后，重量变化也较小，200g 牛膝段酒炙后能得到约 193g 酒牛膝，损失部时产生的碎屑。实验中，按《中国药典》2015 年版一部牛膝项下方法制备了牛膝药材的饮片和酒牛膝饮片。在实验中采用 HPLC 法同时测定了牛膝及其炮制品、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮等 3 个甾酮类成分和人参皂苷 Ro、竹节

图 6-1 牛膝有效成分保护损伤软骨细胞时效性由相对于模型组显著性表 6-5 可知，培养 24h 除混合物中浓度组、混合物高浓度组没有显著性差异（P＞0.05）外，其余各组均有显著性（P＜0.05）；培养 48h 除多糖低浓度组、甾酮皂苷部位中浓度组、混合物中浓度组、混合物高浓度组没有显著性差异（P＞0.05）外，其余各组均有显著性（P＜0.05）；培养 72h 多糖低浓度组、多糖-甾酮皂苷部位低浓度组、多糖-甾酮皂苷部位中浓度组有显著性（P＜0.05），其余各组均无明显显著性（P＞0.05）。由牛膝有效成分保护损伤软骨细胞时效性的图 6-1 可以明显看出与含药血清共培养 24h，加含药血清各组对硝普钠损伤软骨细胞的保护作用十分显著，而与含药血清共培养 48h，72h，保护作用不明显，因此选用与含药血清共培养 24h。2.5.2 牛膝多糖、甾酮皂苷化学部位不同配比对软骨细胞凋亡的影响2.5.2.1 接种取生长良好的第 3 代软骨细胞 ，以 15×103/孔接种于 96 孔板上，板的边缘各孔分别加入 200uL PBS 缓冲液，用含 10%FBS 的 DMEM/F12 培养基 5%CO2，37℃培养 24h。2.5.2.2 干预
【参考文献】

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本文编号：2885001