两面针碱衍生物的合成及其免疫抑制活性研究

发布时间：2020-11-19 21:11

　　 寻找高效、低毒新型免疫抑制剂用于自身免疫性疾病的治疗是当前医药研究的热点之一。课题组前期研究发现氯化两面针碱通过抑制拓扑异构酶Ι(topoisomeraseΙ,TopoΙ)的活性,特异性地促进树突状细胞和巨噬细胞RAW264.7分泌IL-10,显示出潜在免疫抑制活性,可应用于自身免疫性疾病的治疗。但进一步研究发现氯化两面针碱存在水溶性差,口服生物利用度低等缺陷,限制其进一步开发。本课题在此基础上以氯化两面针碱作为先导化合物进行结构修饰,并通过对衍生物进一步活性评价,旨在获得成药性更优的TopoΙ抑制剂类免疫抑制小分子。首先,在查阅文献的基础上,以5-硝基-2,3-萘二酚为起始原料,经七步反应,以40%的总收率完成了两面针碱的全合成。以全合成路线为基础,为获得水溶性改善的两面针碱衍生物,进行如下结构修饰设计:(1)在两面针碱母核C-12位引入羟甲基,经14步反应,以16%的收率合成了衍生物3-4;(2)依据已有构效关系,通过两面针碱母核结构简化获得了三类衍生物,分别为3-22(以苯环替代萘环)、3-28(简化亚甲二氧基)和3-34(简化胡椒环);(3)以衍生物3-34为母核结构,在N原子的对位引入不同含氧基团,合成衍生物3-42、3-48、3-52、3-58和3-59。合成实验部分共完成了8条两面针碱及其衍生物的合成路线,获得了40多个中间体及目标化合物,所有中间体及目标化合物均通过高分辨质谱,1HNMR和13C-NMR确证结构。其次,对合成得到的衍生物及中间体进行了促进IL-10分泌活性、构效关系探讨、细胞毒测试及TopoΙ抑制活性研究。一、在2μM浓度下,分别在骨髓来源树突状细胞(Bone marrow-derived dendritic cells,BMDCs)和巨噬细胞RAW 264.7上进行了目标化合物的促IL-10分泌活性评价。结果表明,在BMDCs上,所有目标化合物及中间体促IL-10分泌活性均弱于对照化合物两面针碱;在巨噬细胞RAW 264.7上,部分化合物促IL-10分泌活性显著优于BMDCs上的活性,其中化合物3-15的活性和氯化两面针碱相当,化合物3-14,3-16和3-4促IL-10升高活性相当于两面针碱的80%和73%。根据在巨噬细胞RAW 264.7上的活性筛选结果,构效关系总结如下:(1)两面针碱母核结构中C-8和C-9位的甲氧基结构是药效必须基团;(2)不同种类阴离子对活性有影响,碘离子替代氯离子使活性减弱;(3)异喹啉环结构为非必须结构,部分开环产物也显示活性;(4)母核结构中N原子对位为醛基取代活性优于羟基取代。选取部分促IL-10升高活性较好的衍生物,分别在巨噬细胞RAW 264.7和正常肝细胞L-02上进行了细胞毒性测试,结果显示部分衍生物细胞毒性弱于对照化合物氯化两面针碱。二、在不同浓度下(2–20μM),评价了目标化合物的TopoΙ抑制活性,结果显示,在20μM浓度下,衍生物2-13、3-4、3-16、3-22、3-28、3-34、3-48、3-51和3-58具有TopoΙ抑制活性;特别是在2μM浓度条件下,化合物2-13、3-4、3-16和3-22仍然显示与两面针碱和喜树碱相当的TopoΙ抑制活性。这一活性测试结果表明化合物2-13、3-4、3-16和3-22在TopoΙ抑制活性和促进IL-10分泌活性之间具有一定的一致性,进一步的对接研究也解释了这些化合物与TopoΙ的作用方式。基于以上活性研究结果,选取化合物3-22和3-48在脓毒症小鼠模型上进行体内活性研究。实验结果显示,衍生物3-22和3-48在10 mg/kg时不能改善脓毒症小鼠的生存率;但在较低浓度3 mg/kg时,衍生物3-48能明显改善脓毒症小鼠的生存率,84 h时小鼠的生存率和氯化两面针碱在3 mg/kg时的生存率相当。结合细胞毒性筛选结果和其他活性数据,衍生物3-48可作为优选化合物进行进一步的研究。综上所述,本论文通过对TopoΙ抑制剂氯化两面针碱结构改造及其促IL-10分泌活性研究,获得了新的具有促IL-10升高活性保持,同时毒性降低,水溶性得到改善的先导化合物。本论文研究希望能为发现活性更好、成药性更优的TopoΙ抑制剂类免疫抑制小分子提供新的方向。
【学位单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R284;R285
【部分图文】：

图 1-2 生物碱在 BMDCs 上活性筛选结果Fig.1-2 The screening results of alkaloids on BMDCs图 1-3 生物碱在巨噬细胞 RAW 264.7 上活性筛选结果Fig.1-3 The screening results of alkaloids on RAW 264.7 cells综合以上结果，氯化两面针碱是截止目前本课题组从天然产物库中筛选获得的活性最优的备选化合物，它能特异性的促进 IL-10 分泌，表现出潜在的免疫抑

图 1-3 生物碱在巨噬细胞 RAW 264.7 上活性筛选结果Fig.1-3 The screening results of alkaloids on RAW 264.7 cells综合以上结果，氯化两面针碱是截止目前本课题组从天然产物库中筛选获得的活性最优的备选化合物，它能特异性的促进 IL-10 分泌，表现出潜在的免疫抑制功能，能够用于新型免疫抑制剂的研究开发。有关氯化两面针碱促进IL-10分泌的机制，本课题组前期也进行了深入研究。做为一个经典的拓扑异构酶 Ι(Topo Ι)抑制剂，其主要作用机制是：通过抑制 TopoΙ 的活性，引起 DNA 损伤，从而激活 DNA 损伤应答和下游通路，进而上调 IL-10 的表达来发挥免疫抑制作用(该部分研究工作尚未发表)。四、拓扑异构酶 I 抑制剂与自身免疫性疾病的关系拓扑异构酶 Ι(TopoΙ)是生物体内广泛存在的一类必须酶，通过切割 DNA 一条链中的磷酸二酯键，进而调节 DNA 的拓扑状态，从而参与 DNA 复制、转录、重组和修复等所有关键核内过程。Topo Ι 抑制剂通过抑制 Topo Ι 的活性，干扰

胞 RAW 264.7 上，除中间体 3-41 不能有效的促进 IL-10 分泌外，其余化合物均能不同程度的上调 IL-10 的表达；化合物 3-46 3-48 为引入羧酸乙酯的简化结构衍生物及其中间体，在巨噬细胞 RAW 264.7 上，除中间体 3-47 不能有效的促进IL-10 的分泌外，其他化合物均能不同程度的上调 IL-10 的表达，目标衍生物 3-48 的活性最好；化合物 3-49 3-52 为引入羟甲基的简化结构衍生物及其中间体，在 RAW 264.7 细胞上，均能不同程度的促进 IL-10 的分泌，中间体 3-51 的活性最好；衍生物 3-56 3-59 为引入异丙氧基和酚羟基的简化结构衍生物及其中间体，除目标化合物 3-58 和 3-59 不能上调 IL-10 的表达外，其余中间体均能不同程度的上调 IL-10 的表达。在上述活性筛选的基础上，选取部分衍生物在 5μM 和 10μM 较高浓度下进行复筛，活性筛选结果见图 4-2。在 5 μM 和 10 μM 浓度下，氯化两面针碱(1-9)和衍生物促进 IL-10 分泌的活性均较在 2 μM 时降低，说明在较低的浓度下，其免疫抑制活性较好。同时实验中发现，氯化两面针碱(1-9)5μM 组贴壁细胞较少，漂浮细胞少，呈现增殖抑制现象。原因可能是化合物在较高浓度下，有较强的抑制增殖的作用，导致促进 IL-10 分泌活性有所降低。
【参考文献】

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本文编号：2890450