基于“蛋白质组-修饰组”研究砂炒炮制对穿山甲蛋白质类成分的影响
发布时间：2021-08-31 23:20
目的基于蛋白质、肽类物质组成及修饰组成的变化,研究砂炒炮制对穿山甲物质基础的影响。方法采用Nano LC-MS/MS对炮制前后穿山甲蛋白质、肽类组成及变化进行分析鉴定,对鉴定的蛋白质、肽类发生的脱酰胺修饰与氧化修饰进行比较。结果穿山甲主要由角蛋白、连接蛋白、桥粒蛋白等结构蛋白及促进角质致密结构形成的异构酶类组成。穿山甲经炮制后,可溶性蛋白质、肽类的鉴定数量未见明显变化,难溶性蛋白质鉴定数量显著降低;炮制后蛋白质、肽类的脱酰胺修饰数量显著增加;炮制后I型、II型角蛋白的鉴定肽段数量显著增加,Asn与Gln发生脱酰胺修饰的数量显著增加;穿山甲炮制前后鉴定肽段的相对分子质量分布及亲疏水性无显著变化。结论尽管炮制会降低穿山甲整体蛋白质鉴定的数量,但可显著增加角蛋白的鉴定肽段数量,可显著提高蛋白质、肽类成分的脱酰胺修饰数量。结果提示炮制过程有利于角蛋白等结构蛋白的蛋白质、肽类成分的溶出与释放。为穿山甲物质基础研究,炮制对角质类动物药物质基础的影响研究等提供依据,也为穿山甲替代资源寻找与评价提供研究思路与方法。
【文章来源】：中草药. 2020,51(13)北大核心CSCD
【文章页数】：8 页
【部分图文】：
穿山甲中鉴定的蛋白质、肽段韦恩图
穿山甲主要含有角质类成分，提取方法参照前期研究[12]，稍作改动。提取流程如图1所示，取穿山甲样品（MS-1～MS-3）、炮山甲样品（PMS-1～PMS-3）各10 mg，每个样品加入1 mL提取液（含4%SDS,20 mmol/L DTT的Tris缓冲液），在65℃水浴孵育过夜，10 000 r/min离心10 min，取上清液为穿山甲提取液，沉淀部分重复上述提取步骤2次，将3次提取液合并，分别为穿山甲提取液（MSs-1～MSs-3）与炮山甲提取液（PMSs-1～PMSs-3），沉淀部分用PBS反复洗涤3次，分别为穿山甲渣（MSp-1～MSp-3）与炮山甲渣（PMSp-1～PMSp-3）。测定穿山甲提取液样品（MSs-1～MSs-3、PMSs-1～PMSs-3）蛋白质量浓度，每个样品中取200μg蛋白质总量的提取液，分别加入3倍体积的丙酮，至于-20℃静置4 h后，10 000 r/min离心10min，弃去上清，用丙酮洗涤1次，挥干丙酮。加入200μL裂解液（含8 mol/L尿素的Tris缓冲液，pH 8）充分溶解蛋白后，加入pH 8的Tris缓冲液1 400μL稀释，按质量百分比加入1%胰蛋白酶，置于37℃水浴孵育过夜；穿山甲渣样品（MSp-1～MSp-3、PMSp-1～PMSp-3）用pH 8的Tris缓冲液混悬，扣除提取液中蛋白质总量后，按质量百分比加入1%胰蛋白酶，置于37℃水浴孵育过夜。穿山甲提取液酶解样品与穿山甲渣酶解样品脱盐，干燥，纯水复溶后测定多肽总量，取20μg多肽溶液，再次干燥后用初始流动相复溶至多肽质量浓度为1μg/μL，待进样。
以I型角蛋白炮制前后的变化为例说明脱酰胺位点、肽段数量、PSM及肽段序列的差异。如图3所示，紫色箭头表示炮制后的I型角蛋白较炮制前新出现的脱酰胺修饰位点，包括Gln75、Asn80、Asn101、Gln178、Gln203与Gln336。以胰蛋白酶酶切后形成的肽段GDLERQNQEYQVLLDVR为例，在炮制前的样品中，仅测到GDLERQNQEYQVLLD VR与GDLERQNQEYQ(+0.98)VLLDVR 2条肽段；而炮制后的样品中，测到了序列相同但是含有不同脱酰胺修饰的肽段共7个，除了炮制前检测到的肽段GDLERQNQEYQVLLDVR与GDLERQNQEYQ(+0.98)VLLDVR外，还包括GDLERQN(+0.98)QE YQVLLDVR、GDLERQ(+0.98)NQEYQVLLDVR、GDLERQ(+0.98)N(+0.98)QEYQVLLDVR、GDLER Q(+0.98)NQ(+0.98)EYQVLLDVR与GDLERQ(+0.98)NQEYQ(+0.98)VLLDVR，分别在Gln334、Asn335、Gln336及Gln339发生了不同组合的脱酰胺修饰。如图3-C所示，比较MS/MS图谱可以看出，根据b离子或y离子的偏差，可准确计算出脱酰胺修饰的位点，序列GDLERQNQEYQVLLDVR的b5+、b6+、b7+、b8+、b9+分别为571.29、699.34、813.39、941.44、1 070.49；而序列GDLERQ(+0.98)NQ(+0.98)EYQVLLDVR的b5+、b6+、b7+、b8+、b9+分别为571.29、700.33、814.37、943.41、1 072.46，两者（b6+-b5+）值分别为128.05与129.04，表明肽段的6位Gln发生了修饰，两者（b7+-b6+）值相同，表明7位Asn未发生修饰，（b8+-b7+）值分别为128.05与129.04，则表明8位Gln也发生了修饰，从而明确脱酰胺修饰的位点。图3结果表明炮制后角蛋白修饰数量显著增加，相同氨基酸序列上发生不同位点修饰使得肽段鉴定数量也明显增加。2.6 穿山甲肽段相对分子质量与亲疏水性分布的对比分析
【参考文献】：
期刊论文
[1]HPLC法同时测定穿山甲炮制品中3个主要环二肽成分的含量[J]. 刘逊,庞博文,王亚琼,汪明志,吴芝远,刘阳,张华锋. 药物分析杂志. 2019(08)
[2]不同炮制火候对砂炒穿山甲性状和环二肽类成分的影响[J]. 刘逊,汪明志,吴芝园,庞博文,张华锋,王亚琼. 中药材. 2019(04)
[3]穿山甲高温砂炒炮制增效机制研究[J]. 刘逊,刘睿,赵呈雷,吴芝园,朱晔,谈如蓝,刘竞天,张迪. 中草药. 2019(07)
[4]基于转录组学-蛋白质组学-多肽组学整合关联分析策略的动物药蛋白多肽类成分研究思路及方法[J]. 杨彬,高文远,张艳军. 中草药. 2019(05)
[5]中药穿山甲的DNA分子鉴定研究[J]. 尹艳,刘逊,王兵,高琳惠,张夏楠. 中国中药杂志. 2017(11)
[6]4种不同基原穿山甲炮制品的鉴定[J]. 刘逊,张华峰,刘雪梅,朱缨,崔小兵. 中药材. 2017(03)
[7]四种穿山甲属动物的生药学研究[J]. 吴芝园,巢建国,刘逊. 现代中药研究与实践. 2015(02)
[8]穿山甲应用及炮制研究进展[J]. 王妍,张国民,哈伟. 中国现代中药. 2015(03)
[9]角蛋白的分子构成、提取及应用[J]. 贾如琰,何玉凤,王荣民,李芳蓉,王艳. 化学通报. 2008(04)
本文编号：3375801
【文章来源】：中草药. 2020,51(13)北大核心CSCD
【文章页数】：8 页
【部分图文】：
穿山甲中鉴定的蛋白质、肽段韦恩图
穿山甲主要含有角质类成分，提取方法参照前期研究[12]，稍作改动。提取流程如图1所示，取穿山甲样品（MS-1～MS-3）、炮山甲样品（PMS-1～PMS-3）各10 mg，每个样品加入1 mL提取液（含4%SDS,20 mmol/L DTT的Tris缓冲液），在65℃水浴孵育过夜，10 000 r/min离心10 min，取上清液为穿山甲提取液，沉淀部分重复上述提取步骤2次，将3次提取液合并，分别为穿山甲提取液（MSs-1～MSs-3）与炮山甲提取液（PMSs-1～PMSs-3），沉淀部分用PBS反复洗涤3次，分别为穿山甲渣（MSp-1～MSp-3）与炮山甲渣（PMSp-1～PMSp-3）。测定穿山甲提取液样品（MSs-1～MSs-3、PMSs-1～PMSs-3）蛋白质量浓度，每个样品中取200μg蛋白质总量的提取液，分别加入3倍体积的丙酮，至于-20℃静置4 h后，10 000 r/min离心10min，弃去上清，用丙酮洗涤1次，挥干丙酮。加入200μL裂解液（含8 mol/L尿素的Tris缓冲液，pH 8）充分溶解蛋白后，加入pH 8的Tris缓冲液1 400μL稀释，按质量百分比加入1%胰蛋白酶，置于37℃水浴孵育过夜；穿山甲渣样品（MSp-1～MSp-3、PMSp-1～PMSp-3）用pH 8的Tris缓冲液混悬，扣除提取液中蛋白质总量后，按质量百分比加入1%胰蛋白酶，置于37℃水浴孵育过夜。穿山甲提取液酶解样品与穿山甲渣酶解样品脱盐，干燥，纯水复溶后测定多肽总量，取20μg多肽溶液，再次干燥后用初始流动相复溶至多肽质量浓度为1μg/μL，待进样。
以I型角蛋白炮制前后的变化为例说明脱酰胺位点、肽段数量、PSM及肽段序列的差异。如图3所示，紫色箭头表示炮制后的I型角蛋白较炮制前新出现的脱酰胺修饰位点，包括Gln75、Asn80、Asn101、Gln178、Gln203与Gln336。以胰蛋白酶酶切后形成的肽段GDLERQNQEYQVLLDVR为例，在炮制前的样品中，仅测到GDLERQNQEYQVLLD VR与GDLERQNQEYQ(+0.98)VLLDVR 2条肽段；而炮制后的样品中，测到了序列相同但是含有不同脱酰胺修饰的肽段共7个，除了炮制前检测到的肽段GDLERQNQEYQVLLDVR与GDLERQNQEYQ(+0.98)VLLDVR外，还包括GDLERQN(+0.98)QE YQVLLDVR、GDLERQ(+0.98)NQEYQVLLDVR、GDLERQ(+0.98)N(+0.98)QEYQVLLDVR、GDLER Q(+0.98)NQ(+0.98)EYQVLLDVR与GDLERQ(+0.98)NQEYQ(+0.98)VLLDVR，分别在Gln334、Asn335、Gln336及Gln339发生了不同组合的脱酰胺修饰。如图3-C所示，比较MS/MS图谱可以看出，根据b离子或y离子的偏差，可准确计算出脱酰胺修饰的位点，序列GDLERQNQEYQVLLDVR的b5+、b6+、b7+、b8+、b9+分别为571.29、699.34、813.39、941.44、1 070.49；而序列GDLERQ(+0.98)NQ(+0.98)EYQVLLDVR的b5+、b6+、b7+、b8+、b9+分别为571.29、700.33、814.37、943.41、1 072.46，两者（b6+-b5+）值分别为128.05与129.04，表明肽段的6位Gln发生了修饰，两者（b7+-b6+）值相同，表明7位Asn未发生修饰，（b8+-b7+）值分别为128.05与129.04，则表明8位Gln也发生了修饰，从而明确脱酰胺修饰的位点。图3结果表明炮制后角蛋白修饰数量显著增加，相同氨基酸序列上发生不同位点修饰使得肽段鉴定数量也明显增加。2.6 穿山甲肽段相对分子质量与亲疏水性分布的对比分析
【参考文献】：
期刊论文
[1]HPLC法同时测定穿山甲炮制品中3个主要环二肽成分的含量[J]. 刘逊,庞博文,王亚琼,汪明志,吴芝远,刘阳,张华锋. 药物分析杂志. 2019(08)
[2]不同炮制火候对砂炒穿山甲性状和环二肽类成分的影响[J]. 刘逊,汪明志,吴芝园,庞博文,张华锋,王亚琼. 中药材. 2019(04)
[3]穿山甲高温砂炒炮制增效机制研究[J]. 刘逊,刘睿,赵呈雷,吴芝园,朱晔,谈如蓝,刘竞天,张迪. 中草药. 2019(07)
[4]基于转录组学-蛋白质组学-多肽组学整合关联分析策略的动物药蛋白多肽类成分研究思路及方法[J]. 杨彬,高文远,张艳军. 中草药. 2019(05)
[5]中药穿山甲的DNA分子鉴定研究[J]. 尹艳,刘逊,王兵,高琳惠,张夏楠. 中国中药杂志. 2017(11)
[6]4种不同基原穿山甲炮制品的鉴定[J]. 刘逊,张华峰,刘雪梅,朱缨,崔小兵. 中药材. 2017(03)
[7]四种穿山甲属动物的生药学研究[J]. 吴芝园,巢建国,刘逊. 现代中药研究与实践. 2015(02)
[8]穿山甲应用及炮制研究进展[J]. 王妍,张国民,哈伟. 中国现代中药. 2015(03)
[9]角蛋白的分子构成、提取及应用[J]. 贾如琰,何玉凤,王荣民,李芳蓉,王艳. 化学通报. 2008(04)
本文编号：3375801
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