基于PI3K/Akt和GCGR/PKA通路探讨石斛合剂抑制糖异生的机制

发布时间：2024-05-26 23:14

　　目的本课题通过体内外实验探讨石斛合剂通过调控PI3K/Akt和GCGR/PKA信号通路改善肝脏胰岛素抵抗,抑制糖异生的作用机制。方法1.大鼠肝组织iTRAQ蛋白组学检测雌性Wistar大鼠40只,随机分为正常组10只和造模组30只。正常组予普通饲料喂养,造模组以高脂高糖饲料喂养6周后腹腔注射2次STZ(25 mg/kg +m2,间隔72 h)。筛选出糖尿病成模大鼠,再随机分为3组(模型组、石斛合剂组和二甲双胍组)。石斛合剂组以石斛合剂1号方(17.2 g/kg·d-l)和石斛合剂2号方(12.4 g/kg·d-1)灌胃,二甲双胍组以二甲双胍灌胃(100mg/kg·d),模型组、正常组用生理盐水灌胃,均持续灌胃60天。各组动物均于最后一次用药后24小时后剖腹取肝组织。利用以iTRAQ为标记的液相色谱质谱联用技术,对大鼠肝脏进行蛋白组学检测,定量观察各组大鼠肝脏的蛋白质差异表达情况,寻找组间的差异蛋白和相关信号通路,为后续研究打下基础。2.动物实验SPF级健康雌性Wistar大鼠50只,随机选取11只为正常组,其余39只大鼠按上述方法造模和分组干预,持续灌胃12周后采血取材。检测空腹血糖、...

【文章页数】：105 页

【学位级别】：博士

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缩略词表
中文摘要
Abstract
前言
第一部分 基于iTRAQ技术的糖尿病大鼠肝组织的蛋白组学研究
    1 材料
        1.1 实验动物
        1.2 实验药物
        1.3 主要试剂与仪器
        1.4 主要试剂配制
    2 研究方法
        2.1 动物模型制备
        2.2 动物分组和干预
        2.3 动物取材
        2.4 iTRAQ检测肝组织蛋白质组学
        2.5 生物信息分析
    3 结果
        3.1. 质谱基本鉴定信息和质量评估
        3.2 COG分类图注释
        3.3 GO注释
        3.4 肝脏组织差异蛋白质的筛选
        3.5 Pathway代谢通路注释
    4 讨论
        4.1 iTRAQ蛋白质组学
        4.2 GO注释
        4.3 肝脏组织差异蛋白质
        4.4 Pathway信号通路富集分析
    5 小结
第二部分 石斛合剂改善糖尿病大鼠胰岛素抵抗抑制糖异生的机制研究
    1 材料
        1.1 实验动物
        1.2 实验药物
        1.3 主要试剂
        1.4 主要仪器
        1.5 主要试剂的配制
    2 研究方法
        2.1 糖尿病大鼠模型的制备
        2.2 动物分组及干预
        2.3 动物取材
        2.4 整体糖脂代谢指标测定
        2.5 ELISA法检测各组空腹胰岛素、胰高血糖素
        2.6 肝脏组织病理学观察
        2.7 免疫组化检测PI3K/AKT和GCGR/PKA通路相关蛋白的表达
        2.8 RT-PCR法检测PI3K/AKT和GCGR/PKA通路相关基因的mRNA表达情况
        2.9 Western bolt检测各组PI3K/Akt和GCGR/PKA通路相关蛋白表达
        2.10 统计学分析
    3 结果
        3.1 动物一般状况
        3.2 各组大鼠血清学指标的变化
        3.3 各组大鼠肝组织HE染色结果
        3.4 石斛合剂对糖尿病大鼠GCGR/PKA和PI3K/AKT通路相关基因表达的影响
        3.5 石斛合剂对大鼠肝组织PI3K/AKT和GCGR/PKA通路相关蛋白表达的影响
    4 讨论
        4.1 糖尿病大鼠模型的构建
        4.2 干预药物石斛合剂和阳性对照药的选择依据
        4.3 石斛合剂对糖尿病模型大鼠糖脂代谢和肝功能的影响
        4.4 石斛合剂对糖尿病模型大鼠肝脏形态学的影响
        4.5 石斛合剂对GCGR/PKA信号通路的影响
        4.6 石斛合剂通过调控P13K/Akt信号通路影响糖异生
        4.7 石斛合剂对糖异生关键限速酶PEPCK和G6Pase的影响
    5 小结
第三部分 石斛合剂对胰岛素抵抗肝细胞糖异生的的作用及其机制
    1 材料
        1.1 细胞
        1.2 药物
        1.3 主要试剂和耗材
        1.4 主要仪器
        1.5 主要试剂配制
    2 研究方法
        2.1 细胞培养、传代与冻存
        2.2 石斛合剂含药血清及空白血清制备
        2.3 MTT法筛选石斛合剂含药血清浓度
        2.4 筛选胰岛素的干预浓度
        2.5 筛选建立IR肝细胞模型的造模胰岛素浓度
        2.6 高胰岛素诱导L02肝细胞胰岛素抵抗模型的建立和鉴定
        2.7 实验分组及干预
        2.8 各组肝细胞糖消耗量的变化
        2.9 Realtime PCR检测各组的InsR、GluR、FoxO1、PEPCK和G6Pase的mRNA表达
        2.10 Western-blotting实验检测PI3K/AKT和GCGR/PKA通路相关蛋白的表达
        2.11 加入PI3K抑制剂后检测PI3K/AKT通路相关蛋白表达的影响
        2.12 统计学处理实验数据
    3 结果
        3.1 MTT法确定石斛合剂含药血清浓度
        3.2 有效胰岛素干预浓度的筛选
        3.3 建立IR肝细胞模型的胰岛素浓度筛选
        3.4 L02细胞IR模型的鉴定
        3.5石斛合剂含药血清对IR肝细胞糖消耗量的影响
        3.6 石斛合剂对各组肝细胞InsR、FoxO1、PEPCK、G6Pase和GCGR的mRNA表达的影响
        3.7 石斛合剂对各组肝细胞PI3K/AKT和GCGR/PKA通路相关蛋白表达的影响
        3.8 加入PI3K抑制剂后石斛合剂对IR肝细胞PI3K/AKT通路相关蛋白表达的影响
    4 讨论
        4.1 肝胰岛素抵抗对糖尿病的影响
        4.2 IR细胞模型构建
        4.3 石斛合剂治疗糖尿病的中药活性成分以及中药含药血清法的应用
        4.4 石斛合剂对IR肝细胞的糖消耗试验的影响
        4.5 石斛合剂通过P13K/Akt信号通路对糖异生的影响
        4.6 石斛合剂通过GCGR/PKA信号通路对糖异生的影响
        4.7 加入PI3K抑制剂后石斛合剂通过P13K/Akt信号通路对糖异生的影响
    5 小结
结论
参考文献
文献综述1 胰高血糖素信号通路与糖尿病肝糖异生的研宄进展
    参考文献
文献综述2 中药活性成分防治糖尿病的研究进展
    参考文献
致谢
作者简历



本文编号：3982435