大黄素抑制肝癌细胞侵袭及诱导其凋亡的效应及机制研究

发布时间：2017-10-09 20:21

  本文关键词：大黄素抑制肝癌细胞侵袭及诱导其凋亡的效应及机制研究

  更多相关文章： 大黄素 肝癌 迁移与侵袭 增殖与凋亡 体内与体外

【摘要】：背景:肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是一种发病率和病死率均较高的恶性肿瘤,由于其症状隐匿,大多数患者确诊时已失去根治性手术的机会,而经肝动脉导管介入治疗及化疗等治疗方式的效果尚未令人满意,因此,从中医药的宝库里发掘具有有效抗肝癌的药物是当前研究的热点。大黄素(Emodin)是从中药大黄里提取的一种有效药物,临床研究发现大黄素具有抑制肺癌、前列腺癌、脑胶质瘤、乳腺癌等多种肿瘤的作用,其机制与通过多种信号通路抑制肿瘤细胞增殖及促进其凋亡有关,同时还能抗肿瘤血管的生成。因此,大黄素抗肿瘤效应具有广谱性、多靶点的特征。据文献报道,大黄素具有抑制肝癌增殖及抗肝癌转移的作用,但是,其作用的具体机制及两者之间的关系尚缺乏实验依据。本课题组长期从事中医药抗肝癌的效应及机制研究,具备较好的实验技术基础并积累了较丰富的经验,在前期的预实验中发现低剂量的大黄素具有抗肝癌转移的效应,而高剂量的大黄素则具有明显的诱导肝癌细胞凋亡的作用,因此,本课题主要从不同浓度的大黄素对肝癌增殖、凋亡及转移的影响及其作用的分子机制进行深入探讨,为大黄素在临床抗肝癌的应用提供一定的基础支撑。研究目的:1.体外观察大黄素对人肝癌细胞系MHCC-97H迁移、侵袭的影响及其作用的分子机制。2.体外观察大黄素对人肝癌细胞系SMMC-7721增殖、凋亡的影响及其作用的分子机制,并在裸鼠体内进行验证。研究方法:1.运用MTT、CCK8方法探索不同剂量的大黄素对MHCC-97H及SMMC-7721肝癌细胞系增殖的影响。2.运用流式细胞术测定不同剂量的大黄素对MHCC-97H及SMMC-7721细胞凋亡的影响。3.从上述实验结果中筛选出合适的Emodin浓度,以具有高侵袭迁移特性的MHCC-97H肝癌细胞系为主要模型,应用Transwell小室迁移实验检测大黄素是否具有抑制MHCC-97H细胞迁移的效应;另外,应用预制Matrige胶的Transwell小室模拟体内细胞外基质,探索大黄素抑制MHCC-97H细胞侵袭的效应。4.通过Western Blot技术检测大黄素作用后肝癌细胞MAPK、AKT等信号通路的p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK、JNK、p-P38、P38、p-AKT、AKT等关键蛋白分子的变化,同时测定与细胞侵袭迁移密切相关的基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9以及细胞凋亡相关分子cleaved caspase-3,9及pro-caspase-3,9等的变化,探究大黄素抑制肝癌细胞增殖、转移及诱导其凋亡的相关信号通路及具体作用的分子机制。5.将SMMC-7721细胞种植至裸鼠右下肢皮下,建立裸鼠肝癌皮下瘤模型,通过腹腔注射不同浓度的大黄素溶液,观察大黄素肝癌裸鼠皮下瘤生长的抑制情况,并将肿瘤标本通过HE染色、免疫组织化学检测PCNA、Ki-67的表达及TUNEL等探索大黄素诱导体内肝癌细胞凋亡的效应,最后通过检测裸鼠血液标本的谷草转氨酶、谷丙转氨酶、γ-谷氨酰转肽酶、碱性磷酸酶、肌酐、尿素氮等指标研究Emodin对裸鼠肝肾功能的影响以明确其安全性。结果:1.MTT实验表明大黄素具有抑制MHCC-97H细胞增殖的作用,且呈时间及剂量依赖性,但在大黄素浓度小于50μmol/L且刺激时间小于24 h时其作用效果较弱。2.流式细胞术结果显示大黄素能剂量依赖性地诱导MHCC-97H细胞凋亡,但当大黄素剂量小于50μmol/L时其作用较小。3.Transwell小室实验发现在大黄素小于50μmol/L的条件下能有效抑制MHCC-97H细胞的迁移和侵袭。4.50μmol/L的大黄素能有效抑制MMP-2、MMP-9的表达,且呈时间依赖性,同时能抑制p-ERK1/2、p-AKT的表达但刺激p-P38的上调,而总的ERK1/2、AKT、P38表达没有明显变化。因此推断大黄素抑制MHCC-97H细胞的迁移和侵袭与抑制MMP-2、MMP-9的表达有关,且可能是通过调节MAPK及AKT信号通路实现的。5.CCK8实验表明大黄素能剂量、时间依赖性地抑制SMMC-7721细胞的增殖。而细胞流式术则表明其能剂量依赖性地诱导细胞凋亡。6.100μmol/L的大黄素能有效抑制p-AKT及轻微抑制p-JNK蛋白的表达,但同时激活了p-ERK1/2、p-P38蛋白而对总的AKT、JNK、ERK1/2、P38无明显作用。同时能有效促进cleaved caspase-3,9并轻微抑制pro-caspase-3,9的表达。7.体内实验结果显示大黄素能有效抑制裸鼠肝癌的生长而不影响裸鼠的体重,HE染色结果表明大黄素能促进肿瘤组织凋亡坏死,而免疫组化结果显示大黄素能有效抑制Ki-67、PCNA的表达并升高TUNEL细胞染色的阳性率,验证了大黄素在体内亦具有抑制肝癌细胞增殖并诱导其凋亡的效应。8.通过肝肾功能指标的检测,我们发现大黄素没有损害荷瘤裸鼠的肝功能及肾功能,提示大黄素抗肝癌无明显毒副作用。结论:1.大黄素在低剂量作用下能有效抑制肝癌细胞MHCC-97H的迁移及侵袭,其分子机制与调节MMP-2、MMP-9的表达及MAPK、AKT信号通路相关。2.大黄素在高剂量时能有效诱导肝癌细胞SMMC-7721的凋亡,其机制可能与激活MAPK并抑制AKT信号通路有关。该结果得到体内研究的证实,且该药未见明显毒副作用。
【关键词】：大黄素 肝癌 迁移与侵袭 增殖与凋亡 体内与体外
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-10
• 缩略词表10-11
• 前言11-13
• 第一部分 大黄素抑制肝癌细胞MHCC-97H迁移与侵袭的效应及机制研究13-29
• 一、实验材料、试剂和仪器13-16
• 二、实验方法16-21
• 三、实验结果21-26
• 四、讨论26-29
• 第二部分 大黄素诱导肝癌细胞SMMC-7721 凋亡的体内外效应及分子机制的研究29-46
• 一、实验材料、试剂和仪器29-30
• 二、实验方法30-34
• 三、实验结果34-43
• 四、讨论43-46
• 全文小结46-47
• 参考文献47-52
• 文献综述 大黄素抗肿瘤作用研究进展52-61
• 参考文献57-61
• 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明61-62
• 致谢62

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本文编号：1002211