虫草素诱导人类非小细胞肺癌细胞凋亡与自噬及其机理的研究

发布时间：2017-10-10 23:36

  本文关键词：虫草素诱导人类非小细胞肺癌细胞凋亡与自噬及其机理的研究

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【摘要】：虫草素是虫草属中一种主要的生物活性物质,近年来被报道具有多种生理活性,例如,抗肿瘤、抗衰老、抗病毒、抗真菌和增强机体免疫力等。目前,虫草素主要通过提取纯化获得,其中纯化方式主要有：离子交换树脂法和大孔树脂法,虽然二者都具有较理想的纯化效果,但回收率低,不利于大规模的工业化生产。此外,研究表明,虫草素可抑制多种肿瘤的生长增殖并诱导其凋亡,然而关于虫草素对人类非小细胞肺癌的作用效果及其作用机理的研究目前还很少。本课题以九州虫草大米培养基为原料,对虫草素的提取纯化工艺进行了优化和改进,首先探究了不同乙醇浓度对虫草素提取量的影响,实验结果表明,虫草素的提取量在乙醇浓度为80%时达到最高；然后比较了AB-8大孔树脂和酸性氧化铝对虫草素的纯化效果,数据分析表明,经两种柱填料纯化后虫草素的纯度相近,均可达到35%左右；但是虫草素的得率差别很大,使用AB-8进行纯化,虫草素得率最高可达36.78%,而酸性氧化铝纯化后虫草素得率可高达83.67%；因此,我们最终选择酸性氧化铝作为柱料对虫草素进行纯化,并进行了生产工艺的公斤级验证,1000g虫草大米培养基可得到纯度为98.20%的虫草素0.89g,虫草素总回收率为39.83%。本课题研究了虫草素抗人类非细胞肺癌的活性。首先,选用SRB法检测了虫草素对A549、H1792、H1299、H460和H157的抑制作用,处理时间分别为24h和48h；结果显示,H1299、H460和H157对虫草素较为敏感,并且抑制率随着虫草素作用时间的延长而升高。然后,对虫草素处理后的H460和H1299细胞进行了流式细胞术和Western blot分析,流式结果表明,使用200μM虫草素处理24h后,H460和H1299的凋亡率可分别达到29.39%和36.55%；Western blot结果显示,虫草素可明显增强Caspase8、Caspase9、Caspase3和PARP的切割水平,并呈时间和浓度依赖效应,这表明在人类NSCLC细胞中,虫草素可诱导Caspase途径依赖的细胞凋亡。细胞中促凋亡蛋白Noxa、Bax表达水平的增加和抗凋亡蛋白Mcl-1、Bcl-2表达水平的降低,表明虫草素可通过线粒体介导的内源通路诱导凋亡；c-FLIP是细胞凋亡的负调控因子,可通过抑制Caspase8的活化来抑制外源凋亡通路,虫草素可显著降低c-FLIPL的表达量,而且c-FLIPL的过表达可缓解虫草素对人类NSCLC细胞的抑制作用,促进细胞的存活,这表明虫草素可通过外源通路诱导细胞凋亡。mTOR信号途径可促进细胞生长和增殖并且对自噬具有负调控作用,在肿瘤细胞中mTOR途径被过度活化。在本研究中,我们发现虫草素可降低人类NSCLC细胞中mTOR下游蛋白4E-BP1和S6K1的磷酸化水平,抑制mTOR途径的活化,进而抑制细胞的生长增殖。LC3II表达量上调和p62表达量下调表明虫草素可诱导人类NSCLC细胞发生自噬；我们推测虫草素可通过抑制mTOR信号途径来诱导细胞自噬。我们还检测了虫草素诱导的细胞自噬对凋亡的作用,使用Atg5 knockdown和LY294002来抑制自噬,然后Western blot和流式细胞术检测虫草素处理后细胞的凋亡水平,结果一致表明虫草素诱导的细胞自噬可促进细胞凋亡。总而言之,我们发现了虫草素抗肿瘤的新机制,希望可以为虫草素应用于人类非小细胞肺癌的临床治疗提供新的理论依据。
【关键词】：虫草素 人类非小细胞肺癌 细胞自噬 细胞凋亡
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 摘要14-16
• ABSTRACT16-18
• 符号说明18-20
• 第一章 前言20-38
• 1.1 虫草素研究进展20-25
• 1.1.1 虫草素的理化性质20
• 1.1.2 虫草素的主要获得途径20-21
• 1.1.2.1 虫草素的化学合成20-21
• 1.1.2.2 天然虫草素的提取21
• 1.1.3 虫草素的分离纯化21-22
• 1.1.3.1 AB-8大孔树脂简介21-22
• 1.1.3.2 酸性氧化铝简介22
• 1.1.4 虫草素的检测方法22
• 1.1.5 虫草素生理活性简介22-25
• 1.1.5.1 增强免疫力作用22-23
• 1.1.5.2 抗菌、抗病毒作用23
• 1.1.5.3 抗肿瘤作用23-25
• 1.1.5.4 其它作用25
• 1.2 非小细胞肺癌的研究现状25-28
• 1.2.1 肺癌的发生25-26
• 1.2.2 非小细胞肺癌的分类26-27
• 1.2.3 非小细胞肺癌治疗现状27-28
• 1.3 细胞凋亡28-32
• 1.3.1 细胞凋亡与肿瘤28-29
• 1.3.2 细胞凋亡的主要信号途径29-31
• 1.3.2.1 细胞外源凋亡途径29-30
• 1.3.2.2 细胞内源凋亡途径30-31
• 1.3.3 c-FLIP在细胞凋亡中的作用31-32
• 1.4 mTOR信号通路32-33
• 1.4.1 mTOR信号通路的组成32
• 1.4.2 mTOR的生物学功能32-33
• 1.5 细胞自噬33-35
• 1.5.1 细胞自噬及其发生过程33-34
• 1.5.2 细胞自噬与肿瘤34-35
• 1.5.2.1 自噬与肿瘤存活34-35
• 1.5.2.2 自噬与肿瘤抑制35
• 1.6 细胞凋亡与自噬35-36
• 1.6.1 凋亡与自噬共同促进细胞死亡35
• 1.6.2 自噬抑制凋亡35-36
• 1.6.3 自噬促进凋亡36
• 1.7 本课题的研究内容和意义36-38
• 第二章 虫草素纯化工艺的优化38-48
• 2.1 实验材料38-39
• 2.1.1 药品和试剂38
• 2.1.1.1 药品38
• 2.1.1.2 试剂38
• 2.1.2 仪器与耗材38-39
• 2.1.2.1 实验仪器38-39
• 2.1.2.2 实验耗材39
• 2.2 实验方法39-41
• 2.2.1 虫草素的提取39
• 2.2.2 虫草素的纯化39-40
• 2.2.3 虫草素结晶与重结晶40
• 2.2.4 虫草素的纯度与结构检测40-41
• 2.2.4.1 紫外光谱测定40
• 2.2.4.2 高效液相色谱检测40-41
• 2.2.4.3 红外图谱测定41
• 2.2.4.4 核磁共振分析41
• 2.2.4.5 质谱分析41
• 2.2.5 统计学分析41
• 2.3 实验结果41-47
• 2.3.1 不同乙醇浓度对虫草素提取量的影响41-42
• 2.3.2 不同乙醇浓度对虫草素洗脱效果的影响42-44
• 2.3.3 虫草素提取工艺的验证44
• 2.3.4 虫草素纯品的纯度检测和结构鉴定44-47
• 2.4 本章小结与讨论47-48
• 第三章 虫草素诱导人类非小细胞肺癌细胞凋亡及其机理的研究48-66
• 3.1 实验材料48-52
• 3.1.1 细胞株48
• 3.1.2 药品和试剂48-49
• 3.1.2.1 药品49
• 3.1.2.2 试剂49
• 3.1.3 仪器和耗材49-50
• 3.1.3.1 主要仪器49-50
• 3.1.3.2 主要耗材50
• 3.1.4 溶液及试剂配方50-52
• 3.1.4.1 细胞培养相关试剂和配方50
• 3.1.4.2 蛋白裂解试剂和配方50-51
• 3.1.4.3 Western blot所用试剂和配方51-52
• 3.1.4.4 其它试剂和配方52
• 3.2 实验方法52-57
• 3.2.1 细胞培养52-53
• 3.2.1.1 细胞传代52-53
• 3.2.1.2 细胞接种53
• 3.2.1.3 细胞冻存53
• 3.2.1.4 复苏细胞53
• 3.2.2 SRB染色测定细胞存活率53-54
• 3.2.3 Western Blot54-56
• 3.2.3.1 提取细胞总蛋白54
• 3.2.3.2 考马斯亮蓝法测定蛋白浓度54-55
• 3.2.3.3 Western blot检测55-56
• 3.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡56-57
• 3.2.5 统计学分析57
• 3.3 实验结果57-64
• 3.3.1 虫草素能抑制NSCLC细胞的生长和增殖57
• 3.3.2 虫草素能诱导NSCLC细胞发生Caspase依赖的凋亡57-60
• 3.3.3 虫草素通过内源途径诱导细胞凋亡60-62
• 3.3.4 虫草素通过外源途径诱导细胞凋亡62-64
• 3.4 本章小结与讨论64-66
• 第四章 虫草素诱导的细胞自噬与凋亡关系的研究66-74
• 4.1 实验材料66-67
• 4.1.1 细胞株66
• 4.1.2 药品与试剂66-67
• 4.1.2.1 药品66
• 4.1.2.2 试剂66-67
• 4.1.3 仪器与耗材67
• 4.1.4 试剂与溶剂配方67
• 4.2 实验方法67-68
• 4.2.1 siRNA转染67
• 4.2.2 其它实验方法67-68
• 4.3 实验结果68-72
• 4.3.1 虫草素可抑制NSCLC细胞中的mTOR信号途径68
• 4.3.2 虫草素可诱导人类NSCLC细胞发生自噬68-69
• 4.3.3 虫草素诱导的细胞自噬可促进细胞凋亡69-72
• 4.4 本章小结与讨论72-74
• 第五章 总结与展望74-76
• 5.1 本文总结74-75
• 5.2 前景展望75-76
• 附录76-77
• 参考文献77-87
• 致谢87-88
• 攻读学位期间发表的学术论文和参加科研情况88-89
• 学位论文评阅及答辩情况表89

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本文编号：1009284