外源性抑癌基因PDCD4在人肺癌细胞系的表达及其对肺癌细胞生长的影响

发布时间：2017-10-12 05:34

  本文关键词：外源性抑癌基因PDCD4在人肺癌细胞系的表达及其对肺癌细胞生长的影响

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【摘要】：目的：肺癌是当今世界最常见的呼吸系统恶性肿瘤之一,近年来其发病率和死亡率均有所上升。2008年流行病统计发现,肺癌发病年龄向年轻化发展,平均发病年龄提前了5～10岁。多年来,众多研究人员和临床医师致力于肺癌的研究,使得肺癌在早期诊断以及综合治疗等诸多方面都有了显著的提高。但是,肺癌的防治工作依然艰难,目前尚没有一种令人满意的治疗方法,肺癌患者的总体治疗效果以及远期预后均较差。近年来,基因治疗因其具有高效、特异性和靶向性强的特点,受到越来越多学者的重视。目前肺癌基因治疗的体外及临床前试验已经取得了令人满意的结果,但要想在临床中广泛应用,还需很长一段时间的努力。PDCD4是近年来发现的具有抑癌作用的基因,主要通过抑制肿瘤细胞的转录和翻译、以及通过上调p21的表达等多种途径抑制肿瘤的发生和发展。目前已有研究表明,肺癌细胞中存在PDCD4表达下调或缺失的现象,但是将外源性抑癌基因PDCD4导入肺癌细胞系能否成功表达?PDCD4表达后对肺癌的形态、生长周期等有何直接影响?这些都是非常值得探索的问题。本研究将外源性抑癌基因PDCD4导入肺癌细胞系,检测其表达情况以及成功表达后对肺癌细胞形态、生长速率以及生长周期等方面的影响,以期为肺癌的基因治疗提供相关依据。方法：1.利用PDCD4真核表达载体和空载体分别转染肺癌细胞系,通过荧光显微镜观察PDCD4转染肺癌细胞系后细胞的生长以及形态变化。2.利用FQ-PCR和Western blot方法分别从RNA和蛋白水平检测转染后PDCD4在肺癌细胞系中的表达情况。3.通过细胞计数的方法,分析转染PDCD4后肺癌细胞生长速率的变化。4.流式细胞术分析转染PDCD4后,肺癌细胞生长周期的变化。结果：1.外源性PDCD4 mRNA和蛋白在肺癌细胞系中均成功表达(1) 用FQ-PCR的方法检测PDCD4mRNA的表达,三次重复实验结果如下,以未转染的肺癌A549细胞系中mRNA的表达量作为归一化标准(1),A549-PDCD4细胞中PDCD4 mRNA的表达量分别为45.99±8.705、27.82±6.114、48.35±2.024, A549-vector中PDCD4 mRNA表达量为0.4628±4.67E-2、0.3252±6.40E-2、0.4679±1.718E-2。可见,PDCD4mRNA在A549-PDCD4细胞中的表达量要远大于A549-vector田胞和未转染细胞中的表达量,且将三次重复实验组间数据进行两两比较(α校正为0.05/3=0.017),结果显示,P值均大于0.017,无统计学差异。说明外源性PDCD4在肺癌细胞系中得到了稳定表达。(2)用Western blot方法检测PDCD4蛋白的表达,结果显示未转染和转染空载体的肺癌细胞中PDCD4蛋白表达较低,而转染PDCD4的肺癌细胞中检测到高水平的PDCD4,也说明外源性PDCD4基因在肺癌细胞系中得到了稳定表达。2.外源性PDCD4的表达能够改变肺癌细胞形态未进行转染及空载体转染的肺癌细胞生长良好,形态正常。细胞呈不规则形状,胞体有多个突起,胞浆中可见细颗粒。PDCD4表达载体转染的A549细胞,其细胞数量和形态发生明显改变：细胞数量较对照组明显减少,大部分细胞体积减小,突起消失,形态变圆。3.外源性PDCD4的表达能够抑制肺癌细胞生长速率转染前一日,将肺癌细胞以每孔5×105的数量接种到六孔板中。转染肺癌细胞系48h后,分别对未转染、转染空载体以及PDCD4这三种肺癌细胞进行计数。三次重复实验结果如下：A549-PDCD4:5.27×105±0.68×105; A549-vector: 8.90×105±0.40×105; A549:9.40×105±0.79×105。将三次重复测量数据进行两两比较,(α校正为0.05/3=0.017),结果显示A549-PDCD4细胞计数较另两组细胞均显著减小(P0.017),而A549-vector细胞与A549细胞计数不存在统计学差异(P0.017)。可见转染外源性PDCD4基因对细胞生长速率起到显著抑制作用。4.外源性PDCD4的表达能够阻断肺癌细胞生长周期为了探讨PDCD4对肺癌细胞生长周期的影响,我们将细胞经PI染色后用流式细胞术检测,结果显示,A549-PDCD4细胞GOG1期细胞比例(79.92%±2.72%)较A549-vector细胞(67.7%±4.56%)和未转染细胞A549(69.52%+3.76%)明显增多(P0.017),空载体组和未转染组细胞差异无统计学意义(P0.017)。而A549-PDCD4细胞S+G2M期细胞比例(20.07%±1.91%)较A549-vector细胞(32.3%±2.37%)和未转染细胞A549(30.48%±4.86%)明显降低(P0.017),同样,空载体组和未转染组细胞差异不明显(P0.017)。说明外源性PDCD4(?)够干扰肺癌A549细胞周期,使大多数细胞周期阻滞在GOG1期,抑制细胞增殖。结论：PDCD4能够改变肺癌细胞形态、抑制生长速率、阻断细胞生长周期,这可能是PDCD4抑制肺癌发生发展的重要机制之一。进一步明确了PDCD4在肺癌发生发展中扮演的重要角色,为将来以PDCD4为靶点进行基因治疗提供了重要的实验依据,开辟了新的思路。随着PDCD4等抑癌基因的不断发现,基因治疗必将成为恶性肿瘤治疗方法中的重要组成部分,在防治肿瘤发生、转移和复发等方面发挥重要作用,具有广阔的临床应用前景。
【关键词】：肺癌 PDCD4 抑癌基因
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 中文摘要10-13
• 英文摘要13-17
• 符号说明17-18
• 第一章 前言18-23
• 1 肺癌的流行病学调查现状18
• 2 肺癌的病因及发病机制18-19
• 3 肺癌的治疗方法19-21
• 3.1 手术治疗19
• 3.2 放射治疗19-20
• 3.3 化学药物治疗20
• 3.4 免疫治疗20-21
• 3.5 基因治疗21
• 4 PDCD4与肺癌发生的关系21-22
• 5 研究目的和意义22-23
• 第二章 综述 抑癌基因PDCD4的研究进展23-29
• 1 PDCD4基因的发现及其结构特点23
• 2 PDCD4基因的生物学特性23-24
• 3 PDCD4与肿瘤发生的关系24-26
• 3.1 PDCD4与肺癌24
• 3.2 PDCD4与食管癌24-25
• 3.3 PDCD4与大肠癌25
• 3.4 PDCD4与肝癌25-26
• 3.5 PDCD4与卵巢癌26
• 4 PDCD4基因的抑癌机制26-27
• 4.1 PDCD4基因能够抑制肿瘤细胞的转录26
• 4.2 PDCD4基因能够抑制肿瘤细胞的翻译26-27
• 4.3 PDCD4基因通过使p21的表达上调抑制肿瘤的恶性转化27
• 5 PDCD4对细胞周期和细胞凋亡的影响27-29
• 5.1 PDCD4对细胞周期的影响27-28
• 5.2 PDCD4对细胞凋亡的影响28-29
• 第三章 材料与方法29-40
• 1 细胞株29
• 2 肺癌细胞系培养29
• 2.1 试剂与材料29
• 2.2 主要仪器设备及其他29
• 2.3 实验方法29
• 3 外源性PDCD4转染肺癌细胞系29-30
• 3.1 试剂与材料29-30
• 3.2 主要仪器设备及其他30
• 3.3 试验方法30
• 4 实时荧光定量PCR30-33
• 4.1 试剂与材料30-31
• 4.2 主要仪器设备及其他31
• 4.3 实验方法31-33
• 5 蛋白质免疫印迹(Western blot)33-38
• 5.1 试剂与材料33-34
• 5.2 主要仪器设备及其他34-35
• 5.3 实验方法35-38
• 6 用流式细胞术检测细胞周期38-40
• 6.1 试剂与材料38
• 6.2 仪器设备38
• 6.3 实验步骤38-40
• 第四章 结果40-45
• 1 外源性PDCD4基因在肺癌细胞系A549中的表达40-41
• 1.1 荧光显微镜下观察外源性PDCD4基因的转染情况40
• 1.2 检测外源性PDCD4 mRNA在肺癌细胞系中的表达水平40-41
• 1.3 检测外源性PDCD4蛋白在肺癌细胞系中的表达水平41
• 2 外源性PDCD4表达对肺癌细胞形态的影响41-43
• 3 外源性PDCD4表达对肺癌细胞生长速率的影响43
• 4 外源性PDCD4表达对肺癌细胞周期的影响43-45
• 第五章 讨论45-48
• 第六章 结论48-50
• 1 结论48
• 2 研究的创新之处48
• 3 研究的局限和不足48
• 4 研究感悟48-50
• 附表50-51
• 参考文献51-58
• 致谢58-60
• 攻读学位期间发表论文目录60-61
• 学位论文评阅及答辩情况表61

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