hMOB2对HepG2细胞迁移、侵袭以及与ECM黏附影响的研究

发布时间：2017-10-13 05:36

  本文关键词：hMOB2对HepG2细胞迁移、侵袭以及与ECM黏附影响的研究

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【摘要】：目的：人单极纺锤体1结合蛋白2(human monopolar spindle-one-binder 2, hMOB2)是hMOB蛋白家族成员之一,研究显示,hMOB2可以调控细胞中细胞核-Dbf2相关激酶(NDR)的活性,影响中心体复制、细胞增殖和细胞凋亡等过程,但是hMOB2的表达与肿瘤细胞的黏附和迁移的关系尚未见报道。本研究的目的就是研究hMOB2是否影响肝癌细胞HepG2的迁移和侵袭以及与细胞外基质(ECM)的黏附,初步阐明hMOB2调控HepG2细胞迁移、侵袭的作用方式及机制。方-法：以HepG2细胞为研究对象,采用慢病毒介导的基因过表达和RNA干扰等手段,在细胞中过量表达hMOB2以及干扰细胞内1iMOB2表达,研究hMOB2对HepG2细胞与ECM黏附、迁移和侵袭的影响。(1)利用RT-qPCR和Western blot方法检测过表达和干扰表达后的细胞中hMOB2的mRNA水平和蛋白水平,并检测1iMOB2对FAK、Src和paxillin的表达以及活性的影响。(2)分别利用MTT和CCK-8方法检测慢病毒介导的hMOB2基因过表达和RNA干扰表达等对HepG2细胞活力的影响。(3)分别利用franswell细胞迁移实验和细胞侵袭实验研究hMOB2对HepG2细胞迁移和侵袭的影响。(4)利用肿瘤细胞与I型胶原的黏附实验以及细胞铺展实验研究hMOB2对HepG2细胞与ECM黏附以及在基质上铺展的影响。(5)利用免疫荧光实验观察hMOB2对HepG2细胞中黏着斑复合体的形成和肌动蛋白纤维的分布、张力纤维装配、丝状和片状伪足形成等的影响。结果：RT-qPCR和Western blot实验结果表明,LV-hMOB2'慢病毒感染后的HepG2细胞中hMOB2过表达,LV-sihMOB2-4感染HepG2细胞后可以有效地敲低hMOB2的表达,因此LV-hMOB2和LV-sihMOB2-4(后续用LV-sihMOB2命名)慢病毒可用于后续细胞水平的实验。(1) MTT实验和CCK-8实验结果显示,与空白对照(Mock)、对照慢病毒(LV-CTL)和对照RNA干扰慢病毒(LV-siCTL)感染组相比,hMOB2过表达(LV-hMOB2组)和RNA干扰表达(LV-siMOB2组)对HepG2细胞的活力无明显影响。(2) Transwell细胞迁移实验和细胞侵袭实验结果显示,hMOB2过表达极显著抑制HepG2细胞的迁移和侵袭过程(p0.01),而RNA干扰敲低hMOB2表达也可以抑制HepG2细胞的迁移和侵袭(p0.05)。(3)肿瘤细胞与I型胶原黏附实验结果显示,hMOB2过表达可以显著促进HepG2细胞与基质的黏附(正0.01),而RNA干扰敲低hMOB2表达则可以抑制HepG2细胞与基质的黏附(p0.05)；另外,细胞铺展结果也显示,hMOB2过表达可以影响HepG2细胞在Ⅰ型胶原上的铺展。(4)免疫荧光染色细胞中paxillin,结果显示,hMOB2过表达可以促进黏着斑的形成,与空白对照(Mock)、对照慢病毒(LV-CTL)和对照RNA干扰慢病毒(LV-siCTL)感染组相比,过表达hMOB2的细胞中黏着斑的数量和大小都显著增加,并分散分布于整个细胞；而RNA干扰敲低hMOB2表达则可以抑制HepG2细胞中黏着斑的形成,并主要分布在细胞周围。利用罗丹明标记的鬼笔环肽染色细胞中的肌动蛋白纤维,结果显示,过表达hMOB2的HepG2细胞中张力纤维粗大、数目增多,细胞边缘的丝状伪足和片状伪足显著减少,而RNA干扰敲低liMOB2表达则可以抑制HepG2细胞中张力纤维的形成, F-actin集中分布在细胞周围或边缘。(5) Western blot实验结果显示,过表达hMOB2可以上调HepG2细胞中pY397FAK、pY925FAK和pY118paxillin,下调pY527Src;而RNA干扰敲低hMOB2表达则可以下调HepG2细胞中pY397FAK. pY925FAK和pY118 paxillin,但对pY527Src无显著影响。无论过表达还是干扰表达hMOB2对细胞中总的FAK、Src和paxillin的表达均无显著影响。结论：本研究结果表明：(1)过表达hMOB2抑制细胞的迁移和侵袭很可能是由于hMOB2过表达促进细胞与ECM的过度黏附所致,而RNA干扰敲低hMOB2表达抑制细胞迁移和侵袭有可能是下调hMOB2表达负调控细胞与ECM黏附的结果。(2) hMOB2过表达和干扰表达对HepG2细胞迁移、侵袭以及对细胞与ECM的黏附的影响可能是通过调控细胞中黏着斑复合体的装配和肌动蛋白细胞骨架纤维的重塑来实现的。(3) hMOB2过表达和干扰表达影响HepG2细胞迁移、侵袭以及细胞与ECM的黏附可能需要通过激活FAK-Src-paxillin信号分子调控黏着斑复合体的装配和肌动蛋白细胞骨架纤维的重塑来实现。
【关键词】：HepG2细胞 hMOB2 细胞迁移 细胞侵袭 细胞黏附
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 中文摘要2-5
• Abstract5-9
• 符号说明9-11
• 1 实验材料与方法11-19
• 2 实验结果和分析19-32
• 3 讨论32-35
• 4 结论35-36
• 5 参考文献36-40
• 综述40-53
• 参考文献46-53
• 附录53-54
• 致谢54-55
• 攻读学位期间完成的论文55-56

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本文编号：1023136