剪切应力引起的细胞膜表面张力变化的可视化研究
发布时间:2017-10-13 10:25
本文关键词:剪切应力引起的细胞膜表面张力变化的可视化研究
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【摘要】:目标:血流剪切应力对肿瘤细胞的定向作用可能是引起肿瘤细胞转移的重要原因之一。剪切应力作用于细胞膜上表面,首先引起细胞膜表面张力的改变,这种物理改变可能是肿瘤细胞定向迁移的基础,但目前尚未有针对剪切应力作用下肿瘤细胞膜表面张力的分布模式的研究。本文将采用荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)技术对剪切应力引起的细胞膜表面张力变化模式及其相关机制进行探究。方法:本文首先采用常规亚克隆技术,利用具备分子弹簧功能的蜘蛛丝蛋白序列(GPGGA)8及一对可以发生FRET的荧光蛋白ECFP/YPet设计制备可以可视化检测细胞膜表面张力变化的FRET探针,并通过人为改变细胞膜表面张力对该探针进行了验证。其次采用平行平板流动腔对HeLa细胞施加不同大小的定常层流剪切应力,并且利用多种试剂作用于细胞膜和细胞骨架,在FRET荧光显微镜下动态记录单个细胞的表面荧光FRET变化。然后通过Meta Fluor软件处理荧光照片,得到细胞FRET ratio图像的整体趋势,而后采用MATLAB软件编程,把细胞图像沿着力的方向分成50等份,得到细胞膜上表面张力的局部变化数据,并采用Hill方程拟合沿流体方向的FRET数据,探究剪切应力作用下细胞膜表而张力的局部分布变化规律。结果:探针的FRET ratio变化可以反映细胞膜表面张力的动态变化;在层流剪切应力的作用下,细胞膜表面张力沿流体方向呈现中游高、上下游低的分布模式,细胞膜表面张力整体水平增高,其幅度与剪切应力大小呈现正相关,且最高点所在位置随力的增大向细胞上游偏移,上游增高幅度大于下游;加载剪切应力之前人为改变细胞膜流动性,苯甲醇处理会使得细胞膜表面张力升高更显著,而胆固醇作用后细胞膜表面张力整体下降明显,但仍然呈现与对照组类似的上下游非均匀性分布变化。采用Nocodazole、 Cytochalasin-D及ML7分别破坏细胞骨架微管、微丝或抑制微丝收缩,细胞膜表面张力在剪切应力作用下仍呈现中间高而上下游偏低的模式;破坏微管使剪切应力作用下细胞膜表面张力的整体增高受到明显抑制,并且局部分布发生了明显变化,最高值幅度有所下降而且向上游侧偏移,而且上下游的变化幅度趋于一致;微丝解聚后对整体表面张力的增高没有显著影响,但却导致上下游表面张力增高幅度的反转;而抑制微丝收缩也在一定程度上抑制了剪切应力作用下细胞膜表面张力的增高,而且对上下游非均匀性分布变化也有显著影响。结论:本文成功构建了可用于可视化检测细胞膜表面张力变化的FRET生物探针,为细胞膜生物物理相关研究提供了一种有力的工具。剪切应力作用下,肿瘤HeLa细胞膜表面张力变化出现了上下游非均匀的分布,可能是流体作用下肿瘤细胞定向迁移的基础。细胞膜流动性的改变对细胞膜表面张力大小存在显著影响,但并不能显著改变剪切应力作用下细胞膜表面张力非均匀分布的规律。细胞骨架的完整性对剪切应力作用下细胞膜表面张力的非均匀分布起着决定性作用,其中微管系统起着主导作用,而微丝系统相对影响较弱。
【关键词】:细胞膜表面张力 剪切应力 细胞膜流动性 细胞骨架
【学位授予单位】:大连理工大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R730.2
【目录】:
- 摘要4-6
- Abstract6-10
- 1 绪论10-18
- 1.1 机械应力在细胞内的信号转导途径10
- 1.2 力在细胞内的物理传导机制10-14
- 1.2.1 力在细胞内的传递途径11-13
- 1.2.2 剪切应力和牵张力的应力物理传递异同13-14
- 1.3 研究细胞内应力物理传导的方法14-17
- 1.3.1 早期的研究方法14-15
- 1.3.2 荧光共振能量转移技术15-17
- 1.4 本文的研究目的17-18
- 2 膜表面张力FRET荧光探针的设计与制备18-33
- 2.1 FRET探针设计18-20
- 2.1.1 原理18-19
- 2.1.2 MSS设计以及KMSS对照设计19-20
- 2.2 材料20-23
- 2.2.1 引物20-21
- 2.2.2 试剂21
- 2.2.3 仪器21-22
- 2.2.4 溶液22-23
- 2.3 方法23-28
- 2.3.1 PCR扩增24
- 2.3.2 核酸纯化24-25
- 2.3.2.1 琼脂糖凝胶电泳24-25
- 2.3.2.2 凝胶回收提纯25
- 2.3.3 限制性酶切25
- 2.3.4 连接25-26
- 2.3.5 质粒转导26
- 2.3.6 质粒提取26-27
- 2.3.7 细胞培养与转染27
- 2.3.8 FRET显微拍照与图像分析27-28
- 2.4 结果28-31
- 2.4.1 测序结果28-29
- 2.4.2 细胞转染荧光验证29-30
- 2.4.3 质粒功能验证30-31
- 2.5 讨论31-33
- 3 剪切应力作用下的细胞膜表面的张力变化33-51
- 3.1 材料和方法33-39
- 3.1.1 试剂33
- 3.1.2 仪器33-34
- 3.1.3 细胞力学加载系统的构建34-36
- 3.1.3.1 剪切应力加载装置34-35
- 3.1.3.2 细胞应力加载35-36
- 3.1.4 实验设计36-37
- 3.1.4.1 实验分组36
- 3.1.4.2 实验试剂配制36-37
- 3.1.4.3 实验步骤37
- 3.1.5 图像分析37-38
- 3.1.6 数据处理与分析38-39
- 3.2 结果39-48
- 3.2.1 不同大小的剪切应力作用下细胞膜表面张力的变化39-42
- 3.2.2 细胞膜流动性对剪切应力作用下细胞膜表面张力分布的影响42-45
- 3.2.3 细胞骨架对剪切应力作用下细胞膜表面张力分布的影响45-48
- 3.3 讨论48-51
- 4 结论51-52
- 参考文献52-58
- 攻读硕士学位期间发表学术论文情况58-59
- 致谢59-60
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 刘波;覃开蓉;;FRET技术在应力信号转导研究中的应用[J];生物医学工程学杂志;2013年06期
,本文编号:1024325
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