尼古丁对人脐带间质干细胞及肺癌细胞株A549生物学特性影响的研究

发布时间：2017-10-14 01:03

  本文关键词：尼古丁对人脐带间质干细胞及肺癌细胞株A549生物学特性影响的研究

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【摘要】：目的:通过实验探讨不同浓度的尼古丁对人脐带间质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell,hUC-MSC)以及肺癌细胞株A549生物学特性的影响来说明其对人体的潜在危害,以期完善尼古丁、间质干细胞和肿瘤之间的关系,为预防和治疗吸烟相关疾病提供实验依据。方法:(1)采用贴壁法分离培养hUC-MSC,利用形态学特征、成骨成脂多向分化潜能和相关基因表达以及表面抗原标记的检测对其进行鉴定。(2)利用MTT法检测尼古丁对hUC-MSC增殖能力的影响,通过浓度梯度筛选出0.1mg/ml、0.2mg/ml和0.3mg/ml作为后续实验的使用浓度;Transwell实验来检测不同浓度的尼古丁对hUC-MSC迁移能力的影响;流式细胞分析仪检测尼古丁对hUC-MSC周期和凋亡的影响;Western blot和免疫荧光检测不同浓度的尼古丁对hUC-MSC相关蛋白的表达。(3)用0.3mg/ml的尼古丁预处理hUC-MSC 24 h后与肺癌细胞株A549共培养24 h。(4)通过Transwell实验和划痕实验来检测共培养后的肺癌细胞株A549的迁移能力。(5)用共培养后的肺癌细胞株A549进行裸鼠皮下成瘤实验来评价共培养后的细胞的致瘤能力。(6)对瘤体进行HE染色和免疫组化分析。结果:(1)从脐带组织块中成功分离出一类呈漩涡样生长的长梭形细胞;经过传代纯化后,能够诱导成为成骨和脂肪细胞,并分别表达相应的基因;流式细胞鉴定符合hUC-MSC表面标记。(2)MTT结果表明尼古丁能够抑制hUC-MSC的增殖,并呈浓度和时间依赖性,当尼古丁的浓度在0.1mg/ml到0.3mg/ml之间,不会抑制hUC-MSC的增殖;随着尼古丁浓度的不断增大,hUC-MSC的迁移能力在增强;流式细胞分析显示经过不同浓度的尼古丁处理后的hUC-MSC重阻滞在S期,细胞凋亡数量也随之增加;Western blot和免疫荧光结果显示E-cadherin蛋白表达降低,N-cadherin、Vimentin、β-catenin等EMT相关蛋白表达均升高,Sox2、Nanog、Sall4、Oct4等干性相关蛋白表达也都有不同程度的升高,Cyclin D1、Cyclin D3等周期相关蛋白表达也均有升高。(3)Transwell实验和划痕实验显示在共培养的条件下,实验组的肺癌细胞株A549迁移能力比对照组的要强;裸鼠成瘤实验显示实验组细胞成瘤的速度、肿瘤的大小、体积和质量均高于对照组;HE和免疫组化染色显示实验组比对照组的细胞排列更加紊乱、高度异型性、核浆比升高、出现病理性核分裂象以及PCNA表达增强。结论:(1)在体外培养条件下,尼古丁能够增强hUC-MSC的迁移能力和干性。(2)经尼古丁预处理的hUC-MSC与肺癌细胞株A549共培养后,使得A549有更强的迁移能力、恶性程度以及体内致瘤能力。
【关键词】：尼古丁 间质干细胞 A549 共培养
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-14
• 英文缩略词中英文注释表14-15
• 第一章 绪论15-23
• 1.1. 概述15-16
• 1.2. 脐带间质干细胞16-21
• 1.2.1. 干细胞16
• 1.2.2. 间质干细胞16-17
• 1.2.3. 脐带间质干细胞17-18
• 1.2.4. 间质干细胞的分离及鉴定18-19
• 1.2.5. 间质干细胞的临床应用19-20
• 1.2.6. 间质干细胞与肿瘤20-21
• 1.2.7. 间质干细胞与毒理学研究21
• 1.3. 尼古丁21-23
• 1.3.1. 尼古丁概述21-22
• 1.3.2. 尼古丁和间质干细胞22
• 1.3.3. 尼古丁与肿瘤的研究22-23
• 第二章 研究目的、方法、方案及意义23-26
• 2.1. 研究目的23
• 2.2. 研究方法23-24
• 2.3. 实验设计方案24-25
• 2.3.1. 间质干细胞的分离和鉴定24
• 2.3.2. 尼古丁对间质干细胞生物学特性的影响24-25
• 2.3.3. 尼古丁处理后的间质干细胞对A549生物特性的影响25
• 2.4. 研究意义25-26
• 第三章 间质干细胞的分离培养和鉴定26-39
• 3.1. 试剂材料与仪器26-27
• 3.1.1. 标本来源26
• 3.1.2. 实验试剂和耗材26-27
• 3.1.3. 实验仪器27
• 3.2. 相关溶液的配制27-28
• 3.2.1. L-DMEM培养液（1000 ml）27-28
• 3.2.2. 双抗的配制28
• 3.2.3. 0.25%胰酶的配制（1000 ml）28
• 3.2.4. PBS的配制（1000 ml）28
• 3.2.5. 冻存液的配制(10 ml)28
• 3.3. 实验方法28-33
• 3.3.1. 细胞的原代分离培养28-29
• 3.3.2. 细胞的传代培养29
• 3.3.3. 细胞的冻存与复苏29-30
• 3.3.4. 细胞表面标记鉴定30
• 3.3.5. 细胞多向分化潜能鉴定30-33
• 3.4. 实验结果33-36
• 3.4.1. 细胞分离培养和鉴定33-34
• 3.4.2. 细胞多向分化潜能鉴定34-35
• 3.4.3. 细胞表面标记鉴定35-36
• 3.5. 讨论36-39
• 第四章 尼古丁对脐带间质干细胞生物学特性的影响39-52
• 4.1. 试剂材料与仪器39-40
• 4.1.1. 实验试剂和耗材39
• 4.1.2. 实验仪器39-40
• 4.2. 相关溶液的配制40-41
• 4.2.1. MTT的配制40
• 4.2.2. 不同浓度的尼古丁的配制40
• 4.2.3. Western-blot相关试剂的配制40-41
• 4.3. 实验方法41-44
• 4.3.1. 尼古丁对间质干细胞增殖的影响41
• 4.3.2. 尼古丁对间质干细胞迁移能力的影响41
• 4.3.3. 尼古丁对间质干细胞周期和凋亡的影响41-42
• 4.3.4. 细胞蛋白的提取42
• 4.3.5. Western-blot42-43
• 4.3.6. 免疫荧光43
• 4.3.7. 统计分析43-44
• 4.4. 实验结果44-50
• 4.4.1. 尼古丁对间质干细胞增殖和形态的影响44-45
• 4.4.2. 尼古丁对间质干细胞迁移能力的影响45-46
• 4.4.3. 尼古丁对间质干细胞周期的影响46-47
• 4.4.4. 尼古丁对间质干细胞凋亡的影响47-48
• 4.4.5. 尼古丁对间质干细胞相关蛋白表达的影响48-50
• 4.5. 讨论50-52
• 第五章 尼古丁处理后的脐带间质干细胞对肺癌细胞株A549生物特性的影响52-63
• 5.1. 试剂材料与仪器52-53
• 5.1.1. 肺癌细胞株和实验裸鼠52
• 5.1.2. 实验试剂和耗材52
• 5.1.3. 实验仪器52-53
• 5.2. 相关溶液的配制53
• 5.2.1. 抗原修复液的配制53
• 5.2.2. 免疫组化专用PBS的配制53
• 5.3. 实验方法53-56
• 5.3.1. 间质干细胞与A549共培养体系的建立53-54
• 5.3.2. Transwell迁移实验54
• 5.3.3. 划痕实验54
• 5.3.4. 平板克隆实验54-55
• 5.3.5. 裸鼠皮下致瘤55
• 5.3.6. 组织切片HE染色55
• 5.3.7. 免疫组化55-56
• 5.3.8. 统计分析56
• 5.4. 实验结果56-61
• 5.4.1. 共培养下对A549迁移能力的影响56-58
• 5.4.2. 共培养下对A549克隆形成能力的影响58-59
• 5.4.3. 共培养促进A549体内生长59-60
• 5.4.4. 肿瘤组织病理切片分析60-61
• 5.5. 讨论61-63
• 第六章 主要结论与展望63-64
• 6.1. 主要结论63
• 6.2. 展望63-64
• 参考文献64-74
• 致谢74-75
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文、获奖及参加会议75
• 一、发表论文情况75
• 二、获奖情况75
• 三、参加会议情况75

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本文编号：1028080