基于DNA甲基化特异性位点区分癌症种类以及同种癌症分型并定量检测血液中的循环肿瘤细胞

发布时间：2017-10-14 11:08

  本文关键词：基于DNA甲基化特异性位点区分癌症种类以及同种癌症分型并定量检测血液中的循环肿瘤细胞

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【摘要】：本论文利用肿瘤特异性甲基化位点构建了一种十分简单的方法用于区分前列腺癌(PC-3)、乳腺癌(MCF-7)、宫颈癌(Hela、Hela-S)四种细胞系以及正常人全血样本。实验中,我们一共测试了12个基因启动子区中共50个Cp G位点。发现在所测试位点中,无论是PC-3、MCF-7、Hela、Hela-S以及正常人全血样本,每个样本都具有各个细胞系特异性的DNA甲基化图谱,无论在基因层面还是单个基因不同位点的层面上都具有很强的特异性。测试得到结果发现仅需测试三个甲基化位点(RA-3、SF-6、GS-5)就可以对实验中设定的5个样本做出鉴定,检出所测样本是以上四种癌细胞系中某种细胞系和正常人全血样本的混合物或单独的正常人全血样本。对未知样本进行该3个位点测试,若RA-3/SF-6/GS-5三个位点测试得到的信号为+/-/-,则该样本为PC-3和正常人全血的混合物;若RA-3/SF-6/GS-5三个位点测试得到的信号为+/+/+,则所测的样本为MCF-7和正常人全血的混合物;若RA-3/SF-6/GS-5三个位点测试得到的信号为-/+/-,则该样本为Hela和正常人全血的混合物;若RA-3/SF-6/GS-5三个位点测到的信号为-/+/+,则该样本为Hela-S和正常人全血的混合物;若RA-3/SF-6/GS-5三个位点的信号为-/-/-,则所测的样本为正常人全血样本。另外通过以上实验所测的这些甲基化位点,我们构建了一种全新的循环肿瘤细胞检测方法。观察本实验所得到的结果,我们发现肿瘤细胞和正常人全血样本在所测试的甲基化位点中有大量在正常人全血中甲基化水平表达量极低或不表达但在各个癌细胞系中甲基化表达水平极高的位点。这些具有明显差异的甲基化位点均可以作为各个癌细胞系的在正常人全血中作为循环肿瘤细胞时检测用的标志物。在所得到的位点中,可以作为MCF-7细胞系的标志位点有CCN-3、GS-4、GS-5、RA-3、RA-4、RA-5、RA-6、RP-1、RP-4、RP-7、SF-6、TIG-5、TNF-1等13个位点;可以作为PC-3的标志位点有RA-3、RA-4、RA-5、RA-6、RP-1、RA-6、RP-7、TIG-5、TNF-1等9个位点;可以作为Hela的标志位点有RP-1、RP-2、RP-4、RP-6、RP-7、SF-6等六个位点;在Hela-S中有CHF-2、CHF-3、GS-3、GS-4、GS-5、SF-6、TNF-1等7个位点。我们选取了RA-3和RA-5位点作为PC-3和MCF-7的标志位点,另外选取了CHF-3位点作为Hela-S的标志位点,均呈现出较好的结果,仅检测当体系中存在2个癌细胞时,均可以和阴性对照组有明显区分,在体系中有2-2000个癌细胞均呈现出很好的趋势。另外相比目前主流的免疫磁珠捕获的方法来说,该方法仅需200μL去血清血液样本就可以得到相当的阳性率。因该方法在检测循环肿瘤细胞时,所检测到的循环肿瘤细胞不仅包含了具有细胞活性的循环肿瘤细胞,所得到的信号也有部分来自于在血液中已经凋亡的循环肿瘤细胞(由于肿瘤细胞脱离原先的组织到血液中后所处的微环境发生巨大变化,大部分血液中的癌细胞处于凋亡状态)。以及当以DNA作为靶标用于检测时,由于血液中数量最多的血红细胞是没有DNA的,因此也清除了在循环肿瘤细胞检测时最大的障碍。相比以m RNA作为特异性靶标对循环肿瘤进行检测的研究工作,DNA的稳定性是m RNA所无法比拟的。此外,该检测方法对样本的新鲜程度要求也更低,并不要求血样是否溶血。
【关键词】：细胞区分 DNA甲基化 循环肿瘤细胞
【学位授予单位】：中国科学院研究生院(上海应用物理研究所)
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.43
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 第一章 绪论12-32
• 1.1 研究背景12-13
• 1.2 循环肿瘤细胞13-17
• 1.2.1 循环肿瘤细胞检测13-14
• 1.2.2 CTCs富集方法14
• 1.2.3 CTC物理检测方法14-15
• 1.2.4 CTC生物学检测方法15
• 1.2.5 CTC微流检测设备15-16
• 1.2.6 磁性细胞分选技术16-17
• 1.3 CTCs检测标志物的选择17-19
• 1.3.1 癌细胞间质转化17-18
• 1.3.2 核酸标志物检测18-19
• 1.4 癌细胞内基因水平变化19-22
• 1.4.1 DNA甲基化与癌症19
• 1.4.2 DNA甲基化修饰19-20
• 1.4.3 与癌症相关DNA甲基化标志物20-21
• 1.4.4 DNA甲基化标志物的癌症检测21-22
• 1.5 本课题的提出22-24
• 参考文献24-32
• 第二章 基于DNA甲基化特异性位点区分癌症种类、以及同种癌症分型32-48
• 2.1 引言32-33
• 2.1.1 研究背景32
• 2.1.2 DNA甲基化检测方法32-33
• 2.2 实验材料33-37
• 2.2.1 材料及试剂33-37
• 2.2.2 细胞37
• 2.3 实验方法37-40
• 2.3.1 细胞培养37
• 2.3.2 各个癌细胞系、正常人全血样本全基因组DNA提取37-38
• 2.3.3 亚硫酸氢钠处理全基因组DNA38-39
• 2.3.4 纯化DNA39
• 2.3.5 DNA脱磺化39
• 2.3.6 甲基化特异性PCR(MSP)39
• 2.3.7 琼脂糖凝胶电泳39-40
• 2.4 实验结果与讨论40-44
• 2.4.1 实验中所检测标靶基因简介40-41
• 2.4.2 不同种类癌细胞鉴定、分型41-44
• 2.5 本章小结44-45
• 参考文献45-48
• 第三章 基于DNA甲基化特异性位点定量检测血液中的循环肿瘤细胞48-59
• 3.1 研究背景48-49
• 3.2 实验材料49
• 3.2.1 材料49
• 3.2.2 主要实验仪器和试剂49
• 3.3 实验方法49-50
• 3.3.1 模拟样本制作49
• 3.3.2 PCR产物纯化49-50
• 3.3.3 微阵列芯片检测PCR产物50
• 3.4 实验结果50-54
• 3.4.1 三种癌细胞模拟样本的检测50-51
• 3.4.2 MCF-7 细胞系模拟样本检测51-52
• 3.4.3 PC-3 细胞系模拟样本检测52-53
• 3.4.4 Hela-S细胞系模拟样本检测53-54
• 3.4.5 DNA提取效率考证54
• 3.5 本章小结54-56
• 参考文献56-59
• 第四章 总结与展望59-61
• 攻读硕士学位期间发表论文目录61-62
• 致谢62-63

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本文编号：1030687