SIRT1在结直肠癌转移中的作用和机制研究

发布时间：2017-10-16 09:34

  本文关键词：SIRT1在结直肠癌转移中的作用和机制研究

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【摘要】：转移的发生是结直肠癌患者死亡的主要原因。虽然研究人员对结直肠癌相关的遗传改变做了广泛的研究,但是至今仍不清楚结直肠癌转移发生中的关键调控基因,这阻碍了转移性结直肠癌患者靶向治疗的开展。作为一种NAD+依赖的去乙酰化酶,SIRT1兼具调节组蛋白和非组蛋白乙酰化水平的活性。既往的研究发现SIRT1在结直肠癌患者中异常高表达,并且与患者病情的恶化和糟糕的整体生存期相关;另外,相比于低转移性的结直肠癌细胞系,SIRT1在高转移性结直肠癌细胞系中的表达水平要明显更高。尽管这些结果提示SIRT1可能参与结直肠癌的转移过程,但是SIRT1在结直肠癌转移中的具体作用和潜在分子调控机制尚无报道。通过这项研究,我们希望能明确SIRT1在结直肠癌转移中的作用,并阐明其相关分子机制,进而为临床上使用SIRT1抑制剂治疗转移性结直肠癌提供理论依据。具体实验方法如下:(1)在低转移性的SW480细胞系中外源表达SIRT1后,western blot实验验证SIRT1蛋白的表达变化,transwell实验分析肿瘤细胞迁移和侵袭能力的变化。(2)在高转移性的SW620、LoVo细胞系中干扰SIRT1后,western blot实验验证SIRT1蛋白的表达变化,Transwell实验分析肿瘤细胞迁移和侵袭能力的变化,划痕实验分析肿瘤细胞迁移能力的变化。(3)建立NOD/SCID小鼠结直肠癌移植瘤模型,研究干扰SIRT1对肿瘤转移能力的影响。(4)通过qRT-PCR实验研究干扰SIRT1后上皮标志物E-cadherin、occludin及间质标志物fibronectin、vimentin mRNA表达水平的变化。通过western blot和免疫荧光实验研究干扰SIRT1后上皮标志物E-cadherin、occludin及间质标志物fibronectin、vimentin蛋白表达水平的变化。通过western blot实验研究SIRT1特异性小分子抑制剂tenovin-6处理后,结直肠癌细胞上皮标志物E-cadherin、occludin及间质标志物vimentin蛋白表达的变化。(5)通过qRT-PCR、luciferase报告基因分析、western blot和免疫荧光等实验研究干扰SIRT1后,Fra-1分别在mRNA、启动子活性、蛋白表达水平的变化。(6)通过western blot和transwell等实验研究Fra-1对SIRT1调控上皮-间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)发生的介导作用。(7)SIRT1和Fra-1在肿瘤组织样本中的免疫组化及临床相关性分析。结果显示:(1)外源表达SIRT1促进结直肠癌细胞的体外迁移和侵袭。(2)干扰SIRT1抑制结直肠癌细胞的体外迁移和侵袭。(3)干扰SIRT1抑制结直肠癌细胞的体内转移。(4)干扰SIRT1促进结直肠癌细胞间质 上皮转化(mesenchymal epithelialtransition,MET)的发生,表明SIRT1调控EMT。(5)干扰SIRT1下调Fra-1在mRNA和蛋白水平的表达,表明SIRT1调控Fra-1表达。(6)干扰Fra-1抑制SIRT1对EMT的调控作用,表明Fra-1介导SIRT1对EMT的调控。(7)SIRT1和Fra-1在结直肠癌患者中的高表达可预测其不良整体生存期。可见,SIRT1可通过调控Fra-1促进EMT的发生和结直肠癌的转移;因此,它是一个潜在的转移性结直肠癌治疗靶点。
【关键词】：结直肠癌 转移 SIRT1 上皮-间质转化 Fra-1
【学位授予单位】：浙江理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.34
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 缩略词表9-13
• 1 引言13-16
• 1.1 结直肠癌转移研究现状13
• 1.2 SIRT1与肿瘤13-16
• 1.2.1 SIRT1分子概述13-14
• 1.2.2 SIRT1功能14
• 1.2.3 SIRT1与肿瘤14-16
• 1.2.3.1 SIRT1与肿瘤转移14
• 1.2.3.2 SIRT1与结直肠癌转移14-16
• 2 实验仪器和材料16-21
• 2.1 主要仪器和耗材16-17
• 2.2 主要试剂及药品17
• 2.3 主要抗体信息17-18
• 2.4 细胞系及培养条件18
• 2.5 主要溶液的配制18-20
• 2.6 反转录PCR引物设计与合成20-21
• 3 实验方法21-33
• 3.1 细胞培养和传代21
• 3.2 慢病毒表达质粒的构建、包装和纯化21-24
• 3.2.1 慢病毒表达质粒构建21
• 3.2.2 慢病毒包装质粒与表达质粒的大量抽提21-22
• 3.2.3 慢病毒包装22-23
• 3.2.4 慢病毒的收集和纯化23
• 3.2.5 慢病毒的生物学滴度测定23
• 3.2.6 慢病毒的感染23-24
• 3.3 NOD/SCID小鼠体内移植实验24
• 3.4 免疫组化染色24-26
• 3.4.1 组织的石蜡包埋及切片24
• 3.4.2 石蜡切片的免疫组化24-25
• 3.4.3 目标蛋白表达等级判定25-26
• 3.5 Transwell侵袭迁移实验26
• 3.6 划痕实验26-27
• 3.7 qRT-PCR检测基因mRNA水平表达差异27-28
• 3.7.1 总RNA的提取27
• 3.7.2 cDNA的制备27-28
• 3.7.3 实时PCR技术检测目的基因mRNA水平表达28
• 3.8 免疫荧光检测基因蛋白水平表达28-29
• 3.9 Western blot检测基因蛋白水平表达29-31
• 3.9.1 收集蛋白29-30
• 3.9.2 SDS-PAGE电泳30
• 3.9.3 转膜30-31
• 3.9.4 封闭31
• 3.9.5 孵育抗体31
• 3.9.6 显影31
• 3.10 基因启动子活性检测31-32
• 3.11 统计学分析32-33
• 4 实验结果与分析33-48
• 4.1 SIRT1对结直肠癌细胞体外迁移和侵袭能力的影响33-36
• 4.1.1 SIRT1的内源表达与结直肠癌细胞的体外迁移能力有关33-34
• 4.1.2 外源表达SIRT1促进结直肠癌细胞的体外迁移和侵袭34-35
• 4.1.3 干扰SIRT1抑制结直肠癌细胞的体外迁移和侵袭35-36
• 4.2 干扰SIRT1对结直肠癌细胞体内转移的影响36-38
• 4.3 干扰SIRT1对结直肠癌细胞EMT发生的影响38-41
• 4.4 SIRT1对Fra-1 的调控作用41-42
• 4.5 Fra-1 在SIRT1调控EMT中的介导作用42-44
• 4.6 SIRT1和Fra-1 在结直肠癌中的临床病理学意义44-48
• 5 讨论48-50
• 6 结论50-51
• 参考文献51-58
• 附录58-59
• 攻读硕士研究生期间的研究成果59-60
• 致谢60

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 尹亚飞;孙慧;马杰;王桂叶;汤平;;SIRT1 mRNA在成人急性白血病骨髓细胞中的表达及其意义[J];中国现代医学杂志;2009年03期

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本文编号：1041927