IL-8促进人乳腺癌细胞EMT的作用及其机制研究

发布时间：2017-10-17 16:00

  本文关键词：IL-8促进人乳腺癌细胞EMT的作用及其机制研究

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【摘要】：目的探讨IL-8(interleukin-8)促进人乳腺癌细胞MCF-7,SK-BR-3上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的作用及其相关机制,初步阐明IL-8在乳腺癌发生发展中的作用。方法1.采用蛋白质印记法(western blotting, WB)和半定量PCR(semi-quantitative RT-PCR)检测人乳腺癌细胞株MCF-7, SK-BR-3, MDA-MB-231内IL-8受体CXCRA, CXCRB的表达；采用细胞因子IL-8处理乳腺癌细胞株MCF-7, SK-BR-3, MDA-MB-231,光学显微镜下观察细胞形态学的变化；Western blotting检测IL-8处理后乳腺癌细胞内EMT标志蛋白上皮钙粘蛋白(E-cadherin),波形蛋白(Vimentin)和纤维连接蛋白(Fibronectin)表达的变化。2.IL-8处理人乳腺癌细胞株MCF-7, SK-BR-3后,采用半定量PCR(semi-quantitative RT-PCR),实时荧光定量PCR (real-time fluorescence quantitative PCR, QRT-PCR)和Western blotting检测EMT相关转录因子Snail mRNA及蛋白水平的变化。3.采用IL-8下游主要信号通路MAPK/ERK1/2, PI3K/AKT, JAK/STAT3的抑制剂及IL-8处理乳腺癌细胞株MCF-7, Western blotting检测信号通路抑制剂对乳腺癌细胞EMT标志蛋白表达的影响；采用PI3K/AKT信号通路的抑制剂及IL-8处理乳腺癌细胞株MCF-7,SK-BR-3,划痕实验检测乳腺癌细胞迁移能力的变化,Boyden小室侵袭实验检测乳腺癌细胞侵袭能力的变化,同时采用半定量PCR(semi-quantitative RT-PCR)及实时荧光定量PCR (real-time fluorescence quantitative PCR, QRT-PCR)检测Snail的mRNA表达变化,采用Western blotting检测EMT标志蛋白E-cadherin, Vimentin, Fibronectin及Snail蛋白表达水平变化。4.采用免疫共沉淀技术以富集乳腺癌细胞株SK-BR-3中Snail及与Snail结合的蛋白。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离免疫沉淀复合物,经银染后将胶按大小大致平均切成三份,送北京华大蛋白公司进行质谱(LC-MSMS)检测。分析质谱结果以筛选与Snail相互作用的蛋白。NCBI数据库查询筛选出来的蛋白的功能特点并采用网页软件PEPSITE检测其与Snai相互结合能力的大小。5.采用免疫组织化学技术(immunohistochemistry, IHC)检测良性乳腺增生、原位乳腺癌及发生淋巴结转移的乳腺癌临床标本中IL-8,CXCRB, E-cadherin, Vimentin, Snail, C14orfl66以及TUBA1B表达水平的相关性。6.建立裸鼠乳腺癌移植瘤模型,瘤内注射IL-8,以验证IL-8对裸鼠乳腺癌生长、肝肺转移的影响,并采用免疫组织化学技术(immunohistochemistry, IHC)检测IL-8对乳腺癌移植瘤内EMT标志蛋白、Snail、C14orfl66以及TUBA1B表达的影响。结果1.Western blotting及半定量PCR结果均表明,1型IL-8受体CXCRA、2型IL-8受体CXCRB在乳腺癌细胞株MCF-7均有表达,而SK-BR-3及MDA-MB-231均只表达2型IL-8受体CXCRB;光学显微镜下观察到IL-8可促进MCF-7, SK-BR-3细胞形态发生EMT,即细胞形态变得细长,出现伪足,细胞间粘附性下降而逐渐发生分离,而MDA-MB-231形态变化不大；Western blotting结果表明IL-8可下调MCF-7, SK-BR-3细胞上皮标志分子E-cadherin的表达,上调间质标志分子Vimentin及Fibronectin的表达,即1L-8可促进乳腺癌细胞株MCF-7, SK-BR-3发生EMT,而对MDA-MB-231细胞作用不明显,后续试验选择乳腺癌细胞株MCF-7, SK-BR-3作为研究对象。2.半定量PCR、实时荧光定量PCR和Western blotting结果均表明,IL-8能显著上调EMT相关转录因子Snail的mRNA及蛋白水平。3. Western blotting结果表明,IL-8通过PI3K/AKT信号通路促进乳腺癌细胞EMT的发生,即对乳腺癌细胞株MCF-7间质标志分子Vimentin表达上调的作用,可被PI3K/AKT信号通路抑制剂阻断；划痕实验及Boyden小室侵袭实验结果也表明,IL-8提高乳腺癌细胞迁移及侵袭的能力,可被PI3K/AKT信号通路抑制剂阻断；IL-8上调Snail, Vimentin, Fibronectin并下调E-cadherin的作用也可被PI3K/AKT信号通路抑制剂阻断。以上结果均表明IL-8可能是通过激活PI3K/AKT信号通路,从而上调EMT相关转录因子Snail的表达、促进乳腺癌细胞EMT的发生。4.免疫共沉淀蛋白复合物经SDS-PAGE分离、质谱定性检测胶内蛋白质,结果分析发现C14orfl66和TUBA1B是与Snail相互作用的蛋白,且NCBI数据库查询到这两个蛋白与癌症侵袭转移相关。网页软件PEPSITE检测到C14orfl66和TUBA1B与Snail相互结合能力较强。采用半定量PCR (semi-quantitative RT-PCR). Western blotting检测,结果表明IL-8可上调C14orfl66和TUBAIB mRNA及蛋白的表达,而PI3K/AKT信号通路抑制剂可阻断此作用。5.免疫组织化学技术(immunohistochemistry, IHC)检测结果表明良性乳腺增生、原位乳腺癌及发生淋巴结转移的乳腺癌临床组织标本中IL-8, CXCRB, Vimentin, Snail, C14orfl66以及TUBA1B表达水平依次增高,相反地,上皮标志物E-cadherin表达依次降低。6.裸鼠乳腺癌移植瘤实验结果表明,注射细胞因子IL-8处理移植瘤后,与对照组相比,肿瘤体积及质量明显增大；小鼠肝、肺组织转移性结节增多,且经HE染色后发现,IL-8处理组肝肺转移明显；移植瘤经免疫组织化学技术检测表明,IL-8处理组Vimentin, Snail, C14orfl66以及TUBA1B表达明显增高,而E-cadherin表达明显下降。结论1.IL-8促进乳腺癌细胞株MCF-7、SK-BR-3 EMT的发生且上调EMT相关转录因子Snail的表达。2.免疫共沉淀实验初步表明C14orfl66、TUBA1B与Snail相互作用,IL-8可通过激活PI3K/AKT信号通路促进乳腺癌细胞EMT的发生、上调Snail及C14orfl66及TUBAIB的表达。3.发生淋巴结转移的乳腺癌临床组织标本中IL-8、CXCRB、Vimentin、 Snail、C14orfl66以及TUBA1B的表达水平明显高于原位乳腺癌及良性乳腺增生疾病。IL-8促进裸鼠乳腺癌移植瘤生长,及肿瘤肝肺转移,并上调瘤内Vimentin, Snail、C14orfl66及TUBA1B的表达,下调E-cadherin的表达。
【关键词】：IL-8 乳腺癌 EMT PI3K/AKT Snail C14orf166
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.9
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照5-7
• 中文摘要7-12
• ABSTRACT12-18
• 前言18-20
• 第一部分 IL-8对人乳腺癌细胞EMT及Snail表达的影响20-30
• 1 材料与方法20-26
• 2 结果26-28
• 3 讨论28-30
• 第二部分 IL-8促人乳腺癌细胞EMT及上调Snail的机制探讨30-41
• 1 材料与方法30-32
• 2 结果32-39
• 3 讨论39-41
• 第三部分 IL-8对裸鼠乳腺癌移植瘤侵袭转移的影响41-48
• 1 材料与方法41-43
• 2 结果43-47
• 3 讨论47-48
• 全文总结48-49
• 参考文献49-52
• 文献综述52-60
• 参考文献56-60
• 致谢60-61
• 攻读硕士期间发表的学术论文61

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本文编号：1049725