TALEN介导MGC803细胞MYH9基因沉默及其对细胞增殖和凋亡的影响

发布时间：2017-10-18 13:51

  本文关键词：TALEN介导MGC803细胞MYH9基因沉默及其对细胞增殖和凋亡的影响

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【摘要】：胃癌(gastric cancer, GC)是消化道最常见的恶性肿瘤之一,也是全世界癌症相关死亡的主要原因。根据美国癌症协会2015年最新统计的全球癌症数据表明,截止2012年,全世界每年约有95.16万胃癌新增病例,并且每年大约有72.31万人死于胃癌。中国、日本和韩国等东亚地区国家依旧是全世界胃癌高发地区,日本和韩国等发达国家因经济水平高、医疗服务体系健全,早期发现诊断胃癌患者居多,所以预后相对较好；约40%的胃癌发生于中国,而中国因经济条件差、医疗水平相对落后,许多胃癌患者明确诊断时已经处于中晚期,因此胃癌死亡率明显高于前者。在我国,最新的癌症统计数据表明,2015年中国估计有429.2万个癌症新发病例和281.4万例癌症死亡病例。胃癌发病率位居男性和女性肿瘤发病原因的第二位和第三位,同时也位居因恶性肿瘤死亡原因的前列。尽管随着大量临床、基础研究的进行以及科技的进步与发展,胃癌的诊疗技术取得了长足发展,但其预后仍不容乐观。影响胃癌预后的因素很多,其中浸润转移仍然是影响胃癌预后的主要因素之一,腹膜转移是最常见的转移方式,占所有转移病例的31%,平均生存时间不足6个月。腹膜转移后导致肿瘤无法根治性切除,同时腹膜转移常合并粘连性肠梗阻、大量腹水等症状,这些因素常导致患者生存质量差、短期死亡。因此,我们应该积极寻找胃癌发生发展过程中与腹膜转移相关的关键分子,研究胃癌发生发展及腹膜转移过程中的具体分子机制,为胃癌患者的个体化治疗提供依据。只有通过这种方式,才有可能做到胃癌的早期发现、早期诊断、早期治疗,改善胃癌患者的预后,为胃癌诊疗技术的发展打下坚实的基础。为了更好的研究与胃癌发生发展及腹膜转移相关的分子调控机制,我们首先必须得了解肿瘤转移的相关理论知识。肿瘤是由遗传因素、环境因素及生活习惯等造成的,是一个分阶段、分步骤,并由多种信号通路共同参与的极为复杂的过程。目前公认的关于胃肠道肿瘤转移的理论主要有四种,直接侵袭、淋巴结转移、血行转移和种植转移。其中淋巴结转移在胃癌中最为常见,它主要表现为肿瘤细胞通过淋巴管转移到胃周各站淋巴结,此外,肿瘤还可以跳跃转移的方式转移至远处淋巴结,胃周淋巴结的清扫对于胃癌术后病理分期、后续治疗及预后的评估具有重要作用。种植转移是引起胃癌腹膜转移的主要原因,胃癌起源于粘膜层,突破浆膜层后因肿瘤细胞脱落至腹腔引起胃癌腹膜转移。既往大量研究证明,正常组织、肿瘤原发灶和肿瘤转移灶之间存在许多的差异性表达基因,正是因为这些差异性表达的基因,导致的肿瘤细胞的生长代谢、粘附能力、运动能力等出现明显改变,进而引起肿瘤细胞侵袭和转移能力明显增强。近年来,随着蛋白质组学(proteomics)技术的发展,蛋白质组学逐渐成为寻找疾病分子标记和药物靶标最有效的方法之一。在对癌症等人类重大疾病的临床诊断和治疗方面,蛋白质组技术也有十分诱人的前景。蛋白质是生理功能和生命现象的执行者与直接体现者,因此,对蛋白质结构与功能的研究将有助于阐明生命在不同条件下的变化机制。蛋白质自身的存在形式与活动规律,例如翻译后修饰、蛋白质之间相互作用及蛋白质构象等问题,仍依靠直接对蛋白质功能的研究来解决,因为蛋白质复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定位或迁移、蛋白质—蛋白质相互作用等几乎无法从mRNA水平来判断。蛋白质组研究的核心技术就是双向凝胶电泳—质谱(Two-dimensional polyacry-lamide gel electrophoresis- mass spec-trometry,2-DE-MS)技术,即利用双向凝胶电泳将所有蛋白质分离,然后通过质谱对蛋白质逐一鉴定,因双向凝胶电泳技术具有繁琐、不稳定和低灵敏度等缺点,荧光差异凝胶电泳(difference gel electrophoresis, DIGE)技术因具有高通量、高灵敏度及高精度等优势,逐渐成为最受欢迎的蛋白组学研究技术之一。立足于临床,针对胃癌复发转移给临床工作带来的挑战,旨在寻找与肿瘤浸润转移相关的生物标志物和生物治疗靶点。前期运用蛋白质组学相关技术对6例胃癌晚期患者(行腹腔镜下胃癌姑息性切除术)的肿瘤原发灶、腹膜转移灶及相应胃正常上皮间组织标本进行差异蛋白质组分析,共鉴定出35个胃癌组织中表达异常的蛋白质,经进一步分析及验证,发现肌球蛋白重链(Myosin, heavy chain 9,non-muscle,MYH9)及人类红细胞膜整合蛋白样蛋白2(Stomatin-like protein 2, SLP-2)与胃癌浸润转移、TNM分期及患者预后相关。根据文献报道,MYH9参与细胞的极性形成、收缩、迁移、细胞分裂等过程,它与许多疾病的发生有关,如遗传性血小板减少症、疱疹病毒感染及胚胎发育等。其在诸多实体肿瘤中表达异常,在胃癌、结肠癌、食管癌及乳腺癌中促进肿瘤的发生与发展,而在头颈部鳞癌中扮演抑癌角色,并与预后呈正相关。作为细胞中的“分子马达”,MYH9异常如何影响胃癌细胞浸润转移引起我们的兴趣,我们前期通过慢病毒干扰构建MYH9基因敲低稳定细胞株,采用最有效和最稳定单克隆株进行相关实验发现：干扰组感染病毒的胃癌细胞形态发生明显改变,细胞间连接疏松、细胞胰酶消化时收缩能力减弱；荧光显微镜下同一视野感染病毒的细胞与未感染细胞形态相差显著。同时,MYH9基因敲低后细胞水平迁移能力增强、侵袭能力减弱。经查阅相关文献,迁移与侵袭能力不一致考虑MYH9作为一个骨架蛋白,主要参与细胞锚定、粘附等过程。因此MYH9减少使细胞粘附减少,水平随机运动增强。因慢病毒干扰构建MYH9基因敲低稳定细胞株存在一些局限性：1、MYH9基因敲低细胞株构建成功后,随着细胞培养及传代次数增加,未转染进病毒的细胞增殖逐渐增多,不能获得稳定敲低的细胞株；2、慢病毒转进去后,能在显微镜下观察到荧光,但其不发挥相应的作用。为进一步验证慢病毒干扰构建MYH9基因敲低稳定细胞株后的相关生物学功能,同时作为潜在的治疗靶点及预后指标,MYH9如何影响胃癌细胞生物学行为也是我们后续的分子机制研究重点。因此,获得可靠的基因敲除细胞模型是深入研究特定基因功能的有力保证。随着分子生物学相关技术的不断发展,基因编辑技术不断涌现并改进,本研究选用效果稳定可靠的类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nuclease,TALEN)技术构建胃癌细胞系MGC803 MYH9基因沉默单克隆株模型,并初步检测MYH9沉默后对细胞增殖和凋亡的影响,为进一步探索MYH9分子机制提供可靠模型及潜在研究方向,为研究胃癌与腹膜转移的分子机制奠定基础。本课题由两个部分组成,具体内容如下：第一章利用TALEN技术构建胃癌细胞MYH9基因沉默细胞株目的：利用新兴的基因编辑技术TALEN技术构建稳定的胃癌细胞MGC803MYH9基因沉默细胞株。方法：根据斯丹赛FastTALETM TALEN试剂盒说明书,设计并构建靶向MYH9基因的TALEN质粒对。通过质粒转染、DNA测序、RT-PCR和western blot等检测质粒活性,成功挑取MYH9基因敲低单克隆株。结果：成功构建MYH9基因敲低单克隆细胞株,因MYH9敲除后细胞致死性,无法得到MYH9基因完全敲除细胞株。第二章MGC803 MYH9基因敲低细胞株验证及其对细胞增殖和凋亡的影响。目的：验证TALEN技术构建的MYH9基因沉默稳定细胞株,并对其相关的细胞增殖和凋亡进行研究,为探索MYH9分子机制提供可靠模型及潜在研究方向。方法：利用qRT-PCR和Western blot方法在mRNA和蛋白水平进行验证,并对构建成功的细胞株进行细胞增殖和凋亡实验。结果：1.成功挑选的单克隆细胞株中MYH9基因在mRNA和蛋白水平均明显低于野生型对照组。2.MYH9敲低后细胞增殖能力下降。3.与野生型对照组相比,MYH9基因敲低后细胞增殖能力下降,细胞周期受阻于G2/M期(P=0.024),不能进入M期进行正常的有丝分裂,同时早期凋亡细胞数目明显增加(P=0.01),差异有统计学意义。通过上述研究,我们可以得到以下结论：1.通过TALEN技术,我们成功构建了胃癌细胞MGC803 MYH9基因稳定敲低细胞株,通过对其验证及相关细胞功能学实验,我们得到了稳定的胃癌MYH9基因敲低单克隆细胞株,为进一步研究胃癌MYH9功能提供了可靠模型,同时也说明TALEN技术是一种有效、稳定的基因编辑技术。2.因只能获得MYH9基因敲低细胞株,而无法得到MYH9基因完全敲除细胞株,这也从侧面反应出了MYH9基因的重要性。3.MYH9基因敲低后细胞增殖能力下降,细胞周期受阻于G2/M期、早期凋亡增加,对于细胞凋亡增多,无法用MYH9基因作为一个骨架蛋白来解释,MYH9是否通过其它机制影响胃癌的发生发展?这为进一步研究MYH9基因分子机制提供了潜在研究方向。本研究的创新之处：首次利用基因编辑技术TALEN技术成功构建胃癌细胞MGC803 MYH9基因敲低细胞株。
【关键词】：TALEN MYH9 细胞增殖 细胞周期 细胞凋亡
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.2
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-17
• 前言17-21
• 第一章 利用TALEN技术构建胃癌细胞MYH9基因沉默细胞株21-36
• 1 实验材料21-23
• 1.1 细胞系及培养条件21
• 1.2 主要试剂及耗材21-22
• 1.3 主要仪器22-23
• 1.4 主要溶液配制23
• 2 试验方法23-31
• 2.1 细胞培养、冻存及复苏23-25
• 2.2 TALEN质粒左右臂构建25-29
• 2.3 TALEN质粒活性检测29-30
• 2.4 利用TALEN质粒建立MGC-803MYH9基因敲低细胞系30-31
• 3 结果31-33
• 3.1 构建TALEN质粒左右臂31
• 3.2 转染细胞并测活性31-32
• 3.3 筛选阳性克隆并成功构建MYH9基因敲低单克隆细胞株32-33
• 4 讨论33-36
• 第二章 MGC803 MYH9基因沉默细胞株验证及细胞增殖与凋亡功能检测36-55
• 1 实验材料36-38
• 1.1 主要试剂及耗材36
• 1.2 主要仪器36-37
• 1.3 主要溶液配制37-38
• 2 实验方法38-48
• 2.1 qRT-PCR检测胃癌细胞中MYH9 mRNA表达38-41
• 2.2 Western blot检测胃癌细胞中MYH9蛋白表达41-47
• 2.3 CCK-8法检测细胞增殖47
• 2.4 流式细胞仪检测细胞周期47-48
• 2.5 细胞凋亡实验检测细胞凋亡情况48
• 2.6 统计方法48
• 3 结果48-53
• 3.1 胃癌细胞株中MYH9基因在mRNA水平的表达情况48-49
• 3.2 胃癌细胞株中MYH9基因在蛋白水平的表达情况49-50
• 3.3 MYH9基因敲低后细胞生长速度受到抑制50-51
• 3.4 MYH9基因敲低后细胞周期受阻于G2/M期51-52
• 3.5 MYH9基因敲低后细胞早期凋亡增加52-53
• 4 讨论53-55
• 全文小结55-56
• 参考文献56-63
• 中英文缩略词表63-66
• 攻读硕士学位期间成果66-67
• 致谢67-69

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 ;Incidence and mortality of gastric cancer in China[J];World Journal of Gastroenterology;2006年01期

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本文编号：1055294