靶向输送microRNA let-7b用于肿瘤的免疫治疗研究

发布时间：2017-10-19 19:51

  本文关键词：靶向输送microRNA let-7b用于肿瘤的免疫治疗研究

  更多相关文章： 肿瘤相关巨噬细胞 肿瘤浸润性树突状细胞 靶向输送 let-7b 肿瘤免疫疗法

【摘要】：恶性肿瘤严重威胁人类健康,通过激活自身免疫系统来杀伤肿瘤细胞是目前肿瘤治疗的研究热点之一。在肿瘤的发生发展过程中,大量的免疫细胞浸润进肿瘤组织,其中肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)和肿瘤浸润性树突状细胞(TIDCs)是肿瘤微环境的重要组成部分,它们在促进肿瘤的生长过程中扮演重要的角色。巨噬细胞可以极化为抗肿瘤作用的M1型和促肿瘤作用的M2型,在肿瘤微环境的作用下,TAMs倾向于极化为促肿瘤作用的M2型；同时TIDCs大部分是未成熟的表型,缺乏抗原提呈能力和触发免疫反应能力。TAMs和TIDCs可以分泌大量生长因子和免疫抑制细胞因子,促进肿瘤细胞的生长和参与维持免疫抑制的环境。因此,通过靶向输送药物至TAMs和TIDCs,促使TAMs由M2表型向M1表型转换及TIDCs的成熟,有可能恢复其抗肿瘤活性。在本文中,我们构建以下的核酸输送系统,该系统由富含甘露糖的阳离子化的白芨多糖(cBSP)、对pH敏感的组胺酸修饰的海藻酸盐(PHA)和let-7b(命名为let-7bvector)一起组成,在显酸性的肿瘤微环境中,可以释放let-7bcBSP纳米复合物。由于TAMs和TIDCs表面富含甘露糖受体,体外实验表明,let-7bcBSP可以通过甘露糖受体介导作用进入TAMs和TIDCs中。之前有报道显示Iet-7b可作为Toll样受体7(TLR-7)激动剂和白细胞介素10(IL-10)抑制剂。细胞实验表明,let-7b上调白细胞介素12(IL-12)的表达同时抑制IL-10的产生；实时荧光定量核酸扩增检测(Q-PCR)结果显示,let-7b上调了M1表面标记诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达,下调了M2表面标记精氨酸酶1(Arg-1)和甘露糖受体(MR)的表达。除了TAMs, TIDCs经let-7b处理后,IL-12分泌能力得到提升,IL-10水平下降。流式结果提示let-b上调了TIDCs活化表面标记(CD40、CD80、CD86和MHC-II),增强了TIDCs刺激T细胞产生和分泌干扰素γ(IFN-γ)的能力。在4T1乳腺癌小鼠模型中,let-7bvector可以有效抑制肿瘤的生长,延长小鼠的存活时间,提高小鼠存活率。随后在体内分布实验中,我们检测了let-7b的细胞定位,结果发现let-7b主要聚集在中瘤组织的TAMs和TIDCs中。在let-7bvector给药后,我们检测TAMs和TIDCs状态,和细胞结果一致,let-7bvector可以逆转TAMs的表型以及上调TIDCs表面成熟标志,同时抑制IL-10的产生和增加了IL-12的表达。随后我们检测肿瘤微环境中细胞因子的变化,结果显示,IL-10、血管内皮生长因子(VEGF)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)的表达量显著降低,同时IL-12的表达量显著升高。综上所述,基于TAMs和TIDCs靶向递送以及let-7b的双重生物功能的给药策略,可以重塑免疫抑制的肿瘤微环境,并且在治疗肿瘤模型小鼠实验中取得了良好的治疗效果,可能可以为肿瘤免疫疗法提供一种有价值的治疗手段。
【关键词】：肿瘤相关巨噬细胞 肿瘤浸润性树突状细胞 靶向输送 let-7b 肿瘤免疫疗法
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.51
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 第一章 绪论11-34
• 一. TAMs和TIDCs与肿瘤的关系11-18
• 1.1 巨噬细胞的功能11-12
• 1.2 TAMs12-15
• 1.2.1 TAMs的表型及特征12-13
• 1.2.2 TAMs在肿瘤发生发展中的作用13-15
• 1.3 TIDCs15-18
• 1.3.1 DCs的功能15-16
• 1.3.2 TIDCs的表型及特征16-17
• 1.3.3 TIDCs在肿瘤发生发展中的作用17-18
• 二. 靶向TAMs与TIDCs治疗肿瘤的研究进展18-23
• 2.1 靶向TAMs在肿瘤治疗中的运用18-20
• 2.1.1 通过控制TAMs的招募18-19
• 2.1.2 促使TAMs由M2型转换成M1型19-20
• 2.1.3 抑制TAMs的存活20
• 2.2 靶向TIDCs在肿瘤治疗中的运用20-23
• 2.2.1 改善TIDCs的抗原提呈能力21
• 2.2.2 恢复TIDCs成熟表型21-23
• 三. Let-7b23-27
• 3.1 核酸在治疗中的运用23-24
• 3.2 let-7家族24
• 3.3 let-7b与肿瘤的关系24-25
• 3.4 let-7b的作用25-27
• 参考文献27-34
• 第二章 实验部分34-59
• 一. 引言34-35
• 二. 实验仪器和实验材料35-36
• 2.1 实验仪器35-36
• 2.2 实验材料36
• 三. 实验方法36-44
• 3.1 阳离子化白芨多糖(cBSP)的制造方法36-37
• 3.2 组氨酸修饰海藻酸盐(Alginate)37
• 3.3 let-7b & vector的制备37
• 3.4 小鼠乳腺癌模型的建立37-38
• 3.5 TAMs的分离38
• 3.6 TIDCs的提取38
• 3.7 let-7b刺激TAMs和TIDCs的能力检测38-39
• 3.8 TAMs的表型转换检测39
• 3.9 细胞转染实验39
• 3.10 let-7b在组织和细胞分布检测39-40
• 3.11 let-7b抗肿瘤能力检测40
• 3.12 Q-PCR40-43
• 3.13 免疫荧光和免疫组化43-44
• 3.13.1 免疫荧光43
• 3.13.2 免疫组化43-44
• 四. 实验结果44-57
• 4.1 体外转染cBSP&let-7b复合物44-46
• 4.2 let-7b的组织中分布和细胞定位46-50
• 4.3 Let-7b逆转TAMs表型和恢复TIDCs免疫功能50-52
• 4.4 let-7b & vector的抗肿瘤活性52-53
• 4.5 体内检测let-7b & vector给药后TAMs和TIDCs状态53-56
• 4.6 let-7 & vector对肿瘤微环境的影响56-57
• 五. 总结与讨论57-59
• 参考文献59-60
• 附录硕士期间发表的论文60-61
• 致谢61-62

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