自噬对甲状腺未分化癌发病机制及放化疗增敏作用的研究

发布时间：2017-10-20 17:22

  本文关键词：自噬对甲状腺未分化癌发病机制及放化疗增敏作用的研究

  更多相关文章： 自噬 PI3K-AKT-mTOR信号通路 甲状腺未分化癌 放化疗敏感性

【摘要】：自噬是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡，与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程，，从而维持细胞内稳态。当细胞面对缺氧、饥饿、电离辐射、化学药物等其他外界刺激时，就会诱导自噬发生，进而激活自噬相关信号通路。研究报道甲状腺肿瘤细胞在应激状态下（如：电离辐射或化学药物等）能够触发自噬，而自噬相关PI3K-AKT-mTOR信号通路的异常表达在分化型甲状腺癌发病过程中发挥着重要作用，但该信号通路在甲状腺未分化癌中致病机制尚不十分清楚。研究发现甲状腺未分化癌中存在PI3KCA异常扩增与突变，针对该通路抑制剂的靶向治疗很可能成为甲状腺未分化癌的新兴治疗策略。PI3K信号通路抑制剂联合放化疗治疗多种恶性肿瘤的研究已成为当下报道焦点，但在甲状腺未分化癌中的相关研究并不多。因此本实验通过研究自噬对甲状腺未分化癌发病机制及放化疗增敏作用，为PI3K-AKT-mTOR信号通路抑制剂联合放化疗治疗甲状腺未分化癌加深理论认识，并为全面完善甲状腺未分化癌的治疗策略开辟新的思路。 目的： 探讨自噬对甲状腺未分化癌发病机制及放化疗增敏作用的影响，研究甲状腺未分化癌放化疗联合自噬抑制剂对肿瘤细胞的毒性作用。 方法： （1）应用荧光显微镜检测甲状腺未分化癌8505c细胞PI3KCA基因的沉默模型转染效果； （2）应用蛋白免疫印迹法检测PI3K-AKT-mTOR信号通路蛋白水平变化； （3）应用细胞增殖CCK-8实验检测甲状腺未分化癌细胞8505c增殖活性； （4）应用MDC荧光法检测甲状腺未分化癌细胞8505c自噬情况； （5）应用SPSS19.0软件分析数据，以P0.05差异具有统计学意义。 结果： （1）构建甲状腺未分化癌细胞8505c PI3KCA沉默模型 根据GenBank中PI3KCA人全长cDNA序列信息，应用Primer3软件设计引物并测序，通过转染带有荧光素酶的慢病毒载体到8505c细胞中，建立稳定的PI3KCA基因沉默模型，同时设立空载体作为对照实验组，通过荧光显微镜观察转染效果，验证成功后扩增培养。 （2）PI3KCA基因及LY294002抑制剂在癌细胞8505c中的作用机制 应用Western Blot及方法对PI3K-AKT-mTOP信号通路相关蛋白的表达进行检测。在癌细胞8505c中分别检测PI3KNC组与PI3KCA沉默组，对照组与LY294002处理组中的AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、p-P70蛋白表达，结果表明PI3KCA沉默组的上述蛋白表达均明显低于PI3KNC组，而LY294002处理组与对照组相比，也显著降低上述蛋白表达。 （3）癌细胞8505c对放化疗敏感性 应用CCK-8方法对癌细胞8505c放化疗作用后的细胞增殖活性进行检测。采用0Gy、2Gy、4Gy、6Gy不同剂量电离辐射分别处理8505c细胞后24h检测细胞增殖活性，结果表明4Gy照射组中细胞增殖活性明显降低（P0.05），随着剂量增加，细胞增殖活性随之降低，细胞毒性增加，我们选择2Gy作为实验放疗剂量。采用0nmol/L、1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L、1umol/L、10umol/L不同浓度表阿霉素分别处理8505c细胞后24h检测细胞增殖活性，结果表明100nmol/L组显著抑制细胞增殖活性（P0.05），随着浓度增加，细胞增殖活性随之降低，细胞毒性增加，我们选择10nmol/L作为实验化疗浓度。 （4）癌细胞8505c对抑制剂LY294002药物敏感性 应用CCK-8方法对癌细胞8505c经不同浓度LY294002处理后的细胞增殖活性进行检测。采用DMSO溶解LY294002，配成0umol/L、2.5umol/L、5umol/L、10umol/L、30umol/L、50umol/L不同浓度工作液分别处理8505C细胞后24h检测细胞增殖活性，结果发现30μmol/L LY294002使细胞增殖活性明显降低（P0.05），我们选择10μmol/L作为实验药物浓度。 （5）PI3KCA基因对癌细胞8505c放疗作用的影响 在癌细胞8505c中应用CCK-8方法对PI3KNC组、PI3KCA沉默组、DMSO组及LY294002处理组给予2Gy辐射处理后分别在4h、8h、12h、24h、48h检测细胞增殖活性，结果表明，PI3KNC组在12h细胞增殖活性明显降低，并且随着时间延长，活性随之降低，而PI3KCA沉默组呈现相同的变化趋势，但与PI3KNC组相比，相同时间点的降低细胞增殖活性更为明显（P0.05）。LY294002处理组与PI3KCA沉默组的作用一致，且其抑制程度较DMSO组显著（P0.05）。 （6）PI3KCA基因对癌细胞8505c化疗作用的影响 在癌细胞8505c中应用CCK-8方法对PI3KNC组、PI3KCA沉默组、DMSO组及LY294002处理组给予10nmol/L表阿霉素处理后分别在12h、24h、36h、48h、72h检测细胞增殖活性，结果表明，PI3KNC组在36h细胞增殖活性显著下降，并且随着时间延长，活性随之降低，而PI3KCA沉默组呈现相同的变化趋势，但在相同时间点的细胞增殖活性明显低于PI3KNC（P0.05）。PLY294002处理组与PI3KCA沉默组的作用一致，且作用效果较DMSO组明显（P0.05）。 （7）自噬对癌细胞8505c放化疗增敏作用的影响 在癌细胞8505c中应用MDC荧光法对未经处理8505c组、PI3KNC组、PI3KCA沉默组、DMSO组及LY294002处理组进行细胞自噬检测。分别对上述各组给予2Gy辐射，培养12h以及给予10nmol/L表阿霉素，培养36h，结果表明PI3KCA沉默组比未经处理8505c组及PI3KNC组能明显增加细胞自噬，而LY294002处理组细胞自噬也显著高于未经处理8505c组及DMSO组。 结论： 1、在甲状腺未分化癌细胞8505c中，沉默PI3KCA基因及应用PI3K抑制剂LY294002均能抑制与自噬相关PI3K-AKT-mTOR信号通路。 2、在甲状腺未分化癌细胞8505c放化疗研究中，最小有效辐射剂量是2Gy，最小有效表阿霉素浓度是10nmol/L，最小有效LY294002药物浓度是10umol/L。 3、CCK-8实验证实沉默PI3KCA基因及应用PI3K抑制剂LY294002均能增加甲状腺未分化癌对放化疗敏感性。 4、MDC实验证实PI3KCA基因及应用PI3K抑制剂LY294002对甲状腺未分化癌的放化疗增敏作用是通过自噬介导的。
【关键词】：自噬 PI3K-AKT-mTOR信号通路 甲状腺未分化癌 放化疗敏感性
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R736.1
【目录】：

• 前言4-6
• 中文摘要6-10
• Abstract10-17
• 第一章 绪论17-23
• 1、 甲状腺乳头状癌17-19
• 1.1 BRAF 癌基因18-19
• 1.2 RET/PTC 基因重排19
• 1.3 RAS 癌基因19
• 2、 滤泡型甲状腺癌19-20
• 2.1 RAS 癌基因20
• 2.2 PAX8-PPARγ基因重排20
• 3、 未分化型甲状腺癌20-22
• 3.1 MAPK 基因突变21
• 3.2 PI3KCA 突变与扩增21-22
• 3.3 TP53 突变22
• 4、 立题依据与展望22-23
• 第二章 材料与方法23-30
• 2.1 主要试剂及器材23-24
• 2.1.1 试剂23-24
• 2.1.2 器材24
• 2.2 主要仪器24-25
• 2.3 细胞培养技术25
• 2.4 PI3KCA 沉默细胞模型的构建25-26
• 2.5 蛋白制免疫印迹法（Western blot）26-28
• 2.5.1 液体配制26-27
• 2.5.2 蛋白样品提取27
• 2.5.3 蛋白浓度测定27
• 2.5.4 SDS-PAGE 凝胶电泳27
• 2.5.5 转膜27-28
• 2.5.6 封闭28
• 2.5.7 免疫反应28
• 2.5.8 化学发光（ECL）与曝光28
• 2.6 放化疗条件28-29
• 2.6.1 照射条件28-29
• 2.6.2 化疗条件29
• 2.7 细胞增殖检测29
• 2.8 单丹磺酰尸胺（MDC）荧光染色法检测自噬29
• 2.9 统计学分析方法29-30
• 第三章 实验结果30-35
• 3.1 构建 8505c PI3KCA 沉默模型30
• 3.2 PI3KCA 基因及 LY294002 抑制剂在癌细胞 8505c 中的作用机制30-31
• 3.3 癌细胞 8505c 对放化疗敏感性31-32
• 3.4 癌细胞 8505c 对抑制剂 LY294002 药物敏感性32
• 3.5 PI3KCA 基因对癌细胞 8505c 放疗作用的影响32-33
• 3.6 PI3KCA 基因对癌细胞 8505c 化疗作用的影响33-34
• 3.7 自噬对癌细胞 8505c 放化疗增敏作用的影响34-35
• 第四章 讨论35-38
• 4.1 PI3KCA 在甲状腺未分化癌中发挥的作用35-36
• 4.2 8505c 细胞对放化疗的细胞毒性作用36
• 4.3 PI3KCA 对 8505c 放化疗增敏作用的影响36-38
• 结论38-39
• 参考文献39-46
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文及科研成果46-47
• 致谢47

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本文编号：1068407