产气荚膜梭菌肠毒素（CPE）对胃癌细胞的杀伤作用及相关机制

发布时间：2017-10-22 19:29

  本文关键词：产气荚膜梭菌肠毒素（CPE）对胃癌细胞的杀伤作用及相关机制

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【摘要】：目的：近期研究显示,产气荚膜梭菌肠毒素(CPE)对Claudin-4蛋白(CL4)高表达的前列腺癌、卵巢癌等显示出毒性杀伤作用,对胃癌的研究尚属空白。本课题通过体内及体外实验,研究CPE对胃癌细胞的杀伤作用及相关机制。方法：1.临床评估：将胃癌组织(30例)、癌旁组织(30例)、正常胃粘膜标本(30例)进行紧密连接蛋白Claudin-4 (CL4)的免疫组化染色,并按1分～5分对免疫组化片子评分,评估三组标本CL4蛋白的表达情况。2.CPE制备：首先合成Clostridiun perfringens SM101 CPE基因序列,并构建正确的Pet28a-CPE表达载体质粒。然后用CaCl2法将连接产物转入大肠杆菌DH5a,常温培养被成功转染的大肠杆菌并用IPTG诱导CPE融合蛋白表达,产物以Ni-IDA纯化,获得纯化的CPE蛋白。3.体外实验：以人胃癌细胞株SGC7901及正常胃粘膜细胞株GES-1为研究对象,采用不同浓度的CPE分别作用于SGC7901和GES-1,MTT法检测CPE处理后各组细胞活性,Western Blot及激光共聚焦法检测CPE处理前后两组细胞CL4蛋白的表达分布情况。采用siRNA沉默CL4的表达,再次用MTT检测CPE处理后两组细胞的活性。4.体内实验：首先用SGC7901细胞瘤块种植于裸鼠皮下的方法建立胃癌皮下移植瘤模型。将28只模型裸鼠随机平均分为4组(每组7只)：对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组。成瘤后每天分别皮下注射对应浓度的药物100μL,对照组注射100μL的PBS,连续注射10天。监测各组裸鼠生长状况、体重、死亡率及肿瘤体积。选取副作用较小且有治疗作用的药物浓度,将14只模型裸鼠分为2组：对照组和CPE处理组,进一步重复实验,监测两组裸鼠肿瘤体积变化情况。结果：1.CL4在胃癌患者的癌组织表达阳性率为66.7%,在癌旁组织中的阳性率为46.7%,均显著高于正常组织的16.7%。2.构建的CPE载体质粒Pet28a-CPE经测序检测,目的片段与基因库序列基本一致。WB验证感受态大肠杆菌表达产物分子量约35×103,与其余文献报道吻合。产物经分析纯度为98%以上,浓度约为10mg/mL。3.在体外实验中,CPE对胃癌细胞SGC7901具有明显的毒性作用。在CPE(0.2mg/L～10mg/L)作用24小时后,MTT可检测出胃癌细胞SGC7901的细胞活性明显低于对照组,其毒性呈剂量依赖。将CL4蛋白沉默后,可看出CPE对SGC7901细胞的杀伤效果明显降低。CPE对正常胃粘膜细胞GES-1无明显毒性作用。进一步研究其机制发现,SGC7901细胞及GES-1细胞均表达CL4,GES-1的相对表达量显著低于SGC7901。激光共聚焦显示,GES-1细胞可形成稳定紧密连接。经CPE处理后,SGC7901细胞膜结构受到破坏,而GES-1可维持细胞膜结构相对完整性。4在动物体内实验中,可观察到20mg/L的CPE对SGC7901皮下移植瘤具有抑制生长作用,且有肠出血,注射部位皮肤坏死等并发症。而当CPE剂量大于30mg/L时,会引起裸鼠在用药第三天开始死亡。结论：产气荚膜梭菌肠毒素CPE对胃癌细胞SGC7901细胞具有杀伤作用,其毒性作用需通过CL4蛋白介导。
【关键词】：胃癌 CPE Claudin-4 紧密连接
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.2
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 英文缩略词表11-12
• 前言12-18
• 1. 胃癌与紧密连接12-13
• 2. 产气荚膜梭菌肠毒素(CPE)13-15
• 3. CPE在恶性肿瘤治疗中的相关研究15-17
• 4. 本课题的研究目的及意义17-18
• 实验材料与仪器18-20
• 1. 主要实验材料18-19
• 2. 主要实验仪器与器械19-20
• 方法20-23
• 1. CPE制备20
• 2. 细胞培养、复苏及冻存20
• 3. 免疫组化20-21
• 4. WB验证Claudin-4在SGC7901细胞及GES-1细胞中的表达21
• 5. MTT法检测不同浓度CPE对SGC7901和GES-1细胞毒性21-22
• 6. 激光共聚焦检测CL4在SGC7901细胞及GES-1细胞上的表达22
• 7. 动物实验22
• 8. 统计学处理22-23
• 结果23-33
• 1. 30例胃癌患者癌组织及癌旁组织Claudin-4表达情况及评分23-24
• 2. CPE的制备24-25
• 3. CPE对SGC7901细胞毒性研究25-30
• 4. CPE对胃癌裸鼠皮下移植模型的治疗作用30-33
• 讨论33-36
• 结论36-37
• 参考文献37-43
• 综述43-56
• 参考文献51-56
• 硕士期间发表的文章56-57
• 致谢57-58

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