HDAC2自身磷酸化对其SUMO E3连接酶活性的作用及机制研究

发布时间：2017-10-24 01:01

  本文关键词：HDAC2自身磷酸化对其SUMO E3连接酶活性的作用及机制研究

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【摘要】：研究背景和目的：组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases, HDACs)是一类锌离子依赖性金属蛋白酶,此酶活性结构域位于蛋白的N末端,介导组蛋白或非组蛋白的去乙酰化修饰,特别是对核小体组蛋白去除乙酰化修饰,可致染色体凝聚而改变核小体结构,强力阻碍靶基因的转录激活,发挥靶基因转录沉默作用,特别是对抑癌基因、凋亡基因和分化基因的转录具有明显的抑制作用,进而诱发肿瘤,被公认为有效的抗癌靶点。目前共发现18种HDACs,按结构和功能可分为四大类,其中Ⅰ类包括HDAC1、2、3和8,其广泛表达于各种真核细胞内,对细胞的增殖、生长、凋亡和分化等发挥着重要的调节作用,与各种肿瘤的发生发展密切相关。其中HDAC2高表达于结直肠癌和肺癌等多种肿瘤中,其表达高低与肿瘤的预后明显相关,抑制HDAC2的活性或表达可显著抑制结直肠癌细胞的增殖和生长,并促进癌细胞凋亡。然而,研究发现持续应用去乙酰化酶抑制剂后,可诱发皮肤T细胞淋巴瘤、结直肠癌和肺癌细胞产生获得性耐药,但其耐药机制仍不清楚。但若将HDAC抑制剂与mTOR通路抑制剂sirolimus联合应用,则能协同增强HDAC抑制剂对结直肠癌的杀瘤效应。由此提示HDAC2在结直肠癌和肺癌等肿瘤的发生、发展和耐药中起重要作用,但其作用机制仍不清楚。另外,我们前期研究还发现,HDAC2除具有去乙酰化酶,直接下调核小体组蛋白的乙酰化修饰,沉默p53、p21、Bax和NOXA等抗细胞增殖和促凋亡相关基因的表达,或者直接去除这些蛋白乙酰化修饰,在结直肠癌的发生发展中发挥重要作用外；其还具有SUMO E3连接酶活性,且通过此功能介导,其可上调翻译起始因子eIF4E的SUMO化修饰,激活帽依赖性mRNA的翻译,上调促细胞增殖和抗细胞凋亡相关基因如ODC、C-myc、Survivin和Bcl-2的表达,在结直肠癌细胞增殖和凋亡调控中发挥重要作用。然而,尽管我们发现并证实HDAC2具有SUMO E3连接酶新功能,且证实此新功能可通过调节真核翻译起始因子eIF4E的SUMO化修饰,而激活帽依赖性mRNA的翻译,但HDAC2的SUMO E3连接酶新功能的生物学意义仍不清楚,特别是此新功能如何协同其去乙酰化酶活性,通过转录沉默和翻译激活而选择性调控有利于肿瘤发生、增殖、生长和凋亡相关基因的表达,在结直肠癌等肿瘤的发生、发展和耐药中发挥重要作用的机制仍不得而知。并提示,单纯阻断HDAC2的去乙酰化酶活性对肿瘤的治疗存在缺陷,这也可能是肿瘤耐药的主要原因。为此我们认为HDAC2双酶活性协同抑制策略可能对肿瘤的治疗具有更好的疗效。然而,目前所有靶向HDAC2的抗肿瘤药物均是针对去乙酰化酶活性而设计,而针对SUMO E3连接酶的抑制剂仍待研发。而要设计研发靶向HDAC2 SUMO E3连接酶活性的抑制剂,我们首先必须了解此酶的活化调控机制。HDACs的活性受到多种机制的调控,包括翻译后修饰、亚细胞定位和辅阻遏蛋白质复合物相互作用。其中,翻译后修饰不仅直接影响HDACs的活性,而且影响其亚细胞定位和蛋白质复合物相互作用,从而间接调控其转录抑制活性。翻译后修饰方式主要包括磷酸化、乙酰化、泛素化和SUMO化等,其中磷酸化是HDAC2的主要翻译后修饰方式,存在于羧基端的S394、S407、S411、S422和S424等5个丝氨酸位点可被磷酸化修饰。另外,分析发现HDAC2的磷酸化修饰区域正好位于其SUMO E3连接酶的结构域内,且磷酸化修饰和SUMO修饰之间存在密切的联系。为此,我们推测HDAC2的自身磷酸化在其SUMO E3连接酶功能的发挥中起重要的调节作用,但有待证实。在体内磷酸化修饰HDAC2的激酶主要是CKⅡ,CKⅡ也可在体内外介导HDAC2394、422和424位丝氨酸的磷酸化修饰。与此相一致,CKⅡ也可介导HDAC1的磷酸化修饰,且突变HDAC1磷酸化位点S421A、S423A而消除其磷酸化修饰,反而促进HDAC1的SUMO化修饰。由此提示,CKⅡ介导的HDAC2自身磷酸化修饰也可能与其自身SUMO化修饰之间存在必然的联系,而HDAC2自身SUMO化修饰是其发挥SUMO E3连接酶活性的基础。然而,关于CK2介导的HDAC2磷酸化修饰对其自身SUMO E3连接酶活性的调控作用还未见报道。为此,本研究将主要采用基因点突变技术,初步探讨HDAC2自身磷酸化对其SUMOE3连接酶的影响和作用,并明确磷酸化修饰对HDAC2 SUMO E3连接酶的调节机制,为进一步设计研发靶向抑制HDAC2 SUMO E3连接酶活性的抗癌新药奠定基础。方法：本研究将首先通过基因点突变和片段缺失突变技术,构建HDAC2已知磷酸化位点S394A、S407A、S411A、S422A和S424A的磷酸化位点突变体和片段缺失突变体,后应用反应HDAC2 SUMO E3连接酶活性报告基因实验鉴定直接去除这些位点磷酸化对其活性的影响和作用；其次再应用CK2激酶的抑制剂四溴苯并三唑(TBB),阻断CK2的活性,证实间接减弱HDAC2的自身磷酸化修饰对HDAC2 SUMO E3连接酶活性的影响和作用；第三,在上述基础上,通过生物信息学分析HDAC2是否存在新的磷酸化修饰位点,后进一步构建HDAC2新磷酸化位点的突变体,后再应用研究报告基因实验、Western-blot实验和细胞增殖实验等探讨HDAC2特定位点的磷酸化修饰对其SUMO E3连接酶活性的影响、机制和生物学意义。结果：1.成功构建了HDAC2的已知磷酸化区域缺失及五个磷酸化位点的负性突变体的真核表达载体。2.报告基因实验证实,HDAC2的已知磷酸化区域缺失突变不影响其SUMO E3连接酶活性,HDAC2的五个已知丝氨酸的磷酸化对其SUMO E3连接酶的活性也不起调节作用。3.CK2的抑制剂四溴苯并三唑(TBB)能抑制CK2介导的HDAC2的自身磷酸化修饰,且此抑制剂对HDAC2介导的帽依赖性翻译报告基因LUC的表达起负向调节作用。4.生物信息学预测分析发现HDAC2的T477和T480位点是两个潜在的自身磷酸化位点,且与野生型相比,T477此位点的磷酸化负性突变体显著增加HDAC2的SUMO E3连接酶反应性报告基因的表达,是野生型的4.24倍,由此提示此位点的磷酸化修饰负性调节HDAC2的SUMO E3连接酶活性。5. IP、western blot和细胞增殖实验证实,HDAC2 T477A的磷酸化负性突变体显著增加HDAC2的自身SUMO化和eIF4E的SUMO化修饰,在翻译水平增强eIF4E调控的靶蛋白(如Bcl-2、cyclin D1、C-myc、Survivin和ODC等)翻译的增加,并促进结肠细胞的增殖。结论：HDAC2的自身磷酸化参与了其SUMO E3连接酶活性的调节,此调节机制与HDAC2的T477位点的磷酸化相关,而与S394、S407、S411、S422和S424五个位点的磷酸化无关。同时,HDAC2 T477的磷酸化对其SUMO E3连接酶的的活性调节为负性调节,即HDAC2 T477A的突变体能显著增强HDAC2自身SUMO化修饰、eIF4E的SUMO化修饰,以及在翻译水平提高eIF4E介导的靶蛋白Bcl-2、cyclin D1、C-myc、 Survivin和ODC表达的增加,并促进结肠癌细胞的增殖。
【关键词】：结、直肠肿瘤 HDAC2 磷酸化修饰 小泛素样修饰 E3连接酶
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.2
【目录】：

• 英文缩略表5-7
• 英文摘要7-11
• 中文摘要11-14
• 第一章 前言14-17
• 第二章 构建HDAC2磷酸化区域缺失和位点负性突变体真核表达载体17-33
• 2.1 材料17-20
• 2.2 方法20-28
• 2.3 结果28-31
• 2.4 讨论31-32
• 2.5 小结32-33
• 第三章 HDAC2自身磷酸化修饰对其SUMO E3连接酶活性的调节作用研究33-41
• 3.1 材料33-35
• 3.2 方法35-37
• 3.3 结果37-38
• 3.4 讨论38-40
• 3.5 小结40-41
• 第四章 新磷酸化位点的预测、负性突变体的构建及其功能鉴定41-54
• 4.1 材料41-43
• 4.2 方法43-47
• 4.3 结果47-51
• 4.4 讨论51-52
• 4.5 小结52-54
• 全文总结54-55
• 参考文献55-59
• 文献综述 HDAC2的翻译后修饰研究进展59-74
• 参考文献67-74
• 攻读硕士期间发表的论文74-75
• 致谢75

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 黄浩;张还添;潘京华;查振刚;;骨关节炎的表观遗传学研究进展[J];广东医学;2014年02期

2 宗实;刘蓉;史娟娟;王s，

本文编号：1086239