乙酰肝素酶调控VEGF-C的表达及其对胰腺癌细胞体外侵袭凋亡的影响

发布时间：2017-10-26 22:06

  本文关键词：乙酰肝素酶调控VEGF-C的表达及其对胰腺癌细胞体外侵袭凋亡的影响

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【摘要】：背景：胰腺癌是目前消化道肿瘤中恶性程度最高,诊治最为困难的肿瘤。据报道,胰腺癌患者诊断后5年生存率为6.8%至25%,手术后病人的中位生存期为8至12个月。由于其生物学行为与解剖位置的特殊性,80%以上的患者发现时病情已属晚期,失去接受根治性手术的机会,早期发现治疗仍是提高患者预后的唯一途径。同时,淋巴结转移是影响患者术后长期生存的独立危险因素,有淋巴结转移者生存期多小于2年。因而,发现一种特异性强灵敏度高的肿瘤标志物是迫切需要的。乙酰肝素酶(HPSE)是一种糖类内切酶,可特异性地切断硫酸乙酰肝素(HS)支链。HS作为一种黏多糖,在细胞外基质(ECM)及细胞表面具有恒定表达。HPSE的活性通过重塑上皮下及内皮下基膜、促进肿瘤细胞的转移及血管生成而实现。血管内皮细胞生长因子C(VEGF-C)可与淋巴管内皮细胞表面的VEGFR-3特异性的结合,因而VEGF-C被认为是促进淋巴管形成的关键细胞因子。肿瘤细胞通过表达VEGF-C提高癌周淋巴管密度(LVD),促进肿瘤细胞经淋巴途径转移。HPSE与VEGF-C均可作为细胞因子协同促进头颈部肿瘤的发生发展,而两者在胰腺癌细胞中的表达关系及对胰腺癌细胞恶性生物学行为的影响尚未阐明。目的：本实验通过构建含人类HPSE基因的质粒及针对HPSE基因的小干扰RNA(siRNA),观察此基因过表达与干扰对BxPC-3细胞(胰腺癌细胞系)VEGF-C表达水平的影响。同时检测转染后细胞体外侵袭能力和凋亡的变化,阐明胰腺癌细胞中两种基因的表达相关性及产生的生物学效应。方法：构建含HPSE基因的重组质粒GV230/HPSE及针对HPSE基因的siRNA,脂质体介导法转染BxPC-3细胞,实时荧光定量PCR技术(RT-qPCR)检测HPSE及VEGF-C的mRNA水平,蛋白免疫印迹技术(Western-blot)检测两种目的蛋白的水平,Transwell侵袭实验及细胞划痕实验观察转染细胞体外侵袭迁移能力的改变,流式细胞术(FCM)评估转染细胞的凋亡情况。结果：RT-qPCR结果显示,GV230/HPSE组与空白对照组相比HPSE mRNA与VEGF-C mRNA分别出现了10.7倍与3.24倍的增高,干扰组则分别出现2.45倍与1.84倍的降低。Western-blot结果显示,GV230/HPSE组HPSE及VEGF-C的蛋白水平均增高(P0.01),HPSE-siRNA组两种蛋白水平均降低(P0.01)。Transwell侵袭实验中,过表达组的侵袭细胞数138±5个,干扰组的侵袭细胞数53±4个,均较空白对照组(104±9个)有统计学意义的差别(P0.05)。流式细胞学结果显示,干扰组早期凋亡细胞占3.63%,晚期凋亡细胞占5.02%,较阴性对照组有轻微提高。结论：HPSE可调控胰腺癌细胞VEGF-C的表达和体外侵袭能力,抑制其表达可诱导细胞凋亡。
【关键词】：胰腺癌 乙酰肝素酶 血管内皮生长因子C RNA干扰 肿瘤侵润
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.9
【目录】：

• 中文摘要6-8
• Abstract8-10
• 符号说明10-11
• 前言11-13
• 1 材料与方法13-17
• 1.1 细胞培养与传代13
• 1.2 设计并合成人HPSE基因过表达载体13-14
• 1.3 设计合成针对HPSE基因的siRNA14
• 1.4 脂质体介导的重组质粒、siRNA转染宿主细胞14
• 1.5 Reverse transrciption-PCR及Real time-qPCR检测HPSE及VEGF-C的mRNA水平14-15
• 1.6 Western blot检测HPSE及VEGF-C蛋白的表达情况15-16
• 1.7 细胞划痕实验与Transwell侵袭实验16
• 1.8 流式细胞术检测HPSE抑制对细胞凋亡影响16
• 1.9 实验数据的处理16-17
• 2 结果17-19
• 2.1 转染效率17
• 2.2 重组质粒及不同干扰片段对HPSE及VEGF-C的mRNA水平影响17
• 2.3 免疫印迹法检测各实验组HPSE与VEGF-C蛋白表达量的变化17-18
• 2.4 各实验组细胞体外侵袭迁移能力的变化18
• 2.5 抑制HPSE对细胞凋亡的影响18-19
• 3 讨论19-22
• 文献综述22-34
• 附录34-39
• 参考文献39-46
• 致谢46-47
• 攻读学位期间发表的学术论文目录47-48
• 学位论文评阅及答辩情况表48

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 李阳;刘浩;黄莹莹;浦龙健;张旭东;蒋志文;蒋琛琛;;顺铂联合肝素酶抑制剂对鼻咽癌细胞增殖和侵袭迁移的影响[J];药学学报;2013年04期

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本文编号：1100642