恶性转化BEAS-2B细胞lncRNAs与miRNAs的差异表达

发布时间：2017-10-27 02:18

  本文关键词：恶性转化BEAS-2B细胞lncRNAs与miRNAs的差异表达

  更多相关文章： 苯并(a)芘 BEAS-2B细胞 长链非编码RNA mRNA 微小RNA

【摘要】：目的长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在一定范围内调控着生物功能的延续或中断,其差异表达已被认为是肿瘤的一个标志性特征。微小RNA(microRNA,mi RNA)可负向调节基因表达,且可与lncRNAs相互作用。本研究旨在探索致癌物诱导的永生化人支气管上皮细胞(immortalized human bronchial epithelial,BEAS-2B)lncRNAs和miRNAs的差异表达,为进一步的机制研究提供依据。方法1.以煤焦沥青烟气提取物(coal tar pitch extracts,CTPE)、烟草烟雾凝集物(cigarette smoke condensate,CSC)为染毒物,处理BEAS-2B细胞,体外构建细胞恶性转化模型。以苯并(a)芘[benzo(a)pyrene,B(a)P]为阳性对照,染毒浓度5μg/m L;二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)为溶剂对照,染毒浓度2‰;CTPE及CSC染毒浓度分别为2.4μg/m L与25μg/m L。通过细胞形态学观察、划痕实验、克隆形成实验、细胞增殖活力及凋亡率检测评估细胞是否发生恶性转化。2.对空白对照组和分别经B(a)P及CTPE诱导的恶性转化BEAS-2B进行LncRNA/mRNA表达谱芯片及MicroRNA表达谱芯片检测。3.生物信息学方法筛选差异表达lncRNAs及mi RNAs,并进行real time-PCR验证。结果1.体外恶性转化细胞模型建立BEAS-2B细胞对于CSC的半数抑制浓度(median inhibitory concentration,IC50)约为0.084mg/m L。B(a)P、CTPE、CSC染毒20代、30代细胞镜下轮廓模糊,胞内出现空泡,细胞膜肿胀变形,出现畸变的细胞核等。划痕实验结果显示B(a)P、CTPE、CSC染毒细胞迁移距离均大于DMSO组细胞(均P0.05);B(a)P、CTPE、CSC组细胞克隆形成数均高于DMSO组(均P0.05),随代数增加,克隆形成数也增加(均P0.05);细胞增殖活力实验结果显示B(a)P、CTPE、CSC染毒细胞吸光度值均大于DMSO组(均P0.05),随代数增加,细胞增殖活力增大(均P0.05);凋亡率检测发现B(a)P、CTPE、CSC染毒细胞凋亡率均小于DMSO组(均P0.05),且随细胞代数增加,凋亡率下降(均P0.05)。2.Lnc RNA/mRNA表达谱芯片检测结果以Fold change≥1.5,P0.05进行差异lncRNAs筛选,B(a)P 30组中检出差异表达lncRNAs 263种,其中,较之空白对照组表达上调的有159种,下调104种;CTPE 30组中有707种lncRNAs差异表达,其中,有408种表达上调,299种下调;且差异表达lncRNAs中antisense与intergenic两类比例较高。以Fold change≥1.5,P0.05进行差异mRNAs筛选,B(a)P 30组中共检出差异表达mRNAs159种,其中,表达上调的有99种,60种下调;CTPE 30组中有569种mRNAs差异表达,其中,有357种上调,212种下调。3.MicroRNA表达谱芯片检测结果利用Fold change≥2.0,P0.05进行差异miRNAs筛选,B(a)P 30组中共检出差异表达miRNAs 127种,其中,较之空白对照组表达上调的有29种,98种下调;CTPE 30组中有78种mi RNAs差异表达,其中,有52种表达上调,26种下调。4.Real time-PCR验证结果与空白对照组及DMSO组相比,B(a)P、CTPE、CSC处理组lncRNAs中有ENST00000501520、ENST00000556926、ENST00000535078表达上调,TCONS_00011820表达下调;miRNAs中hsa-miR-2115-3p和hsa-miR-4521表达下调。结论CTPE、CSC可诱导BEAS-2B细胞发生恶性转化,且随代数增长,细胞恶性程度增加;并使LncRNA/mRNA表达谱及MicroRNA表达谱发生改变。其中,参与细胞周期调控的lncRNA-ENST00000556926表达上调,hsa-miR-4521表达下调;参与调控细胞增殖的lncRNA-ENST00000501520表达上调,hsa-miR-2115-3p表达下调。
【关键词】：苯并(a)芘 BEAS-2B细胞 长链非编码RNA mRNA 微小RNA
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 英文缩略词汇表9-14
• 1 引言14-17
• 2 材料与方法17-29
• 2.1 材料17-21
• 2.1.1 细胞株17
• 2.1.2 煤焦沥青17
• 2.1.3 烟草烟雾凝集物17
• 2.1.4 实验仪器17-19
• 2.1.5 主要试剂19-20
• 2.1.6 试剂配制20-21
• 2.2 实验方法21-29
• 2.2.1 细胞培养21
• 2.2.2 细胞染毒处理21-22
• 2.2.3 CCK-8 细胞活性检测22-23
• 2.2.4 细胞划痕实验23
• 2.2.5 平板克隆形成实验23-24
• 2.2.6 MTT实验检测细胞增殖活力24
• 2.2.7 流式细胞术检测细胞凋亡24
• 2.2.8 TRIzol法提取细胞总RNA24-25
• 2.2.9 RNA质量控制25
• 2.2.10 Arraystar Human LncRNA/mRNA表达谱芯片25-26
• 2.2.11 miRCURY? LNA Array micro RNA表达谱芯片26
• 2.2.12 RNA逆转录26-27
• 2.2.13 Real-time PCR27-28
• 2.2.14 统计分析28-29
• 3 结果29-60
• 3.1 细胞活性检测确定CSC染毒浓度29-30
• 3.2 细胞恶性转化模型建立30-39
• 3.2.1 细胞形态学观察30-31
• 3.2.2 细胞划痕实验检测细胞迁移能力31-34
• 3.2.3 平板克隆形成实验34-35
• 3.2.4 MTT实验检测细胞增殖活力35-37
• 3.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡率37-39
• 3.3 恶性转化BEAS-2B细胞RNA表达谱芯片39-60
• 3.3.1 细胞总RNA纯度及完整性测定结果39-40
• 3.3.2 Arraystar Human LncRNA/m RNA表达谱芯片结果40-54
• 3.3.3 miRCURY? LNA Array microRNA表达谱芯片结果54-56
• 3.3.4 Real time-PCR验证芯片数据56-60
• 4 讨论60-66
• 5. 结论66-67
• 参考文献67-73
• 综述73-99
• 参考文献90-99
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果99-100
• 致谢100

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本文编号：1101504