一株可应用于嵌合体抗原受体基因修饰的细胞治疗技术的CD19单克隆抗体的筛选与鉴定

发布时间：2017-10-28 02:07

  本文关键词：一株可应用于嵌合体抗原受体基因修饰的细胞治疗技术的CD19单克隆抗体的筛选与鉴定

  更多相关文章： 单克隆抗体 嵌合抗原受体 NK-92MI细胞 CD19 B细胞淋巴瘤

【摘要】：目的利用鼠杂交瘤技术筛选和制备治疗性CD19单克隆抗体,并探讨基于获得的CD19 scFv序列构建的CD19-CAR(pCD19-CAR)是否能特异性杀伤CD19阳性B细胞淋巴瘤细胞。方法利用偶联多肽免疫小鼠制备CD19单克隆抗体,然后用基因测序的方法获得抗体的序列。分析抗体序列,并通过基因合成和分子克隆技术构建pCD19片段,而后将pCD19片段克隆到带有CAR的慢病毒载体(PG1-CAR-pCDH)上,即pCD19-CAR-pCDH。病毒包装制备后,将其转染NK-92MI细胞。最后用流式细胞术检测被pCD19-CAR-pCDH瞬时转染的NK-92MI细胞对CD19阳性细胞株的杀伤率。结果(1)成功筛出了特异性强的CD19单克隆抗体—pCD19;(2)用抗体检测CD19阳性细胞株Ramos和Raji,结果显示Ramos的阳性率为84.3%,Raji的阳性率为85.6%,与商业化抗体结果相似;(3)杀伤结果显示未被基因修饰的NK-92MI细胞对CD19阳性细胞株Ramos和Raji细胞的基础杀伤效率分别为27.6%和21.8%;被pCD19-CAR片段瞬时转染的、pCD19-CAR阳性率为28.72%的NK-92MI细胞对上述两种细胞的杀伤效率分别为48.6%和44.1%;对于CD19阴性细胞株Jurkat,不论是未被基因修饰的NK-92MI或者是被pCD19-CAR片段修饰过的NK-92MI,几乎不存在特异性杀伤,杀伤效率分别为15.5%和17.8%。结论成功筛选出了具有高度特异性的CD19单克隆抗体,并利用其scFv序列成功构建了pCD19-CAR。经过pCD19-CAR片段修饰的NK-92MI细胞对CD19阳性细胞株的杀伤明显高于未被基因修饰过的NK-92MI细胞,说明被pCD19-CAR修饰过的NK-92MI细胞能特异性的识别CD19抗原并杀伤CD19阳性的肿瘤细胞株,显示出其在对CD19阳性的B细胞淋巴瘤的免疫治疗中的潜力。
【关键词】：单克隆抗体 嵌合抗原受体 NK-92MI细胞 CD19 B细胞淋巴瘤
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R733.1
【目录】：

• 中文摘要4-5
• Abstract5-7
• 引言7-10
• 实验材料10-14
• 1.1 实验用细胞系10
• 1.2 主要试剂与材料10-11
• 1.3 主要仪器与设备11
• 1.4 主要试剂的配制11-14
• 实验方法14-26
• 2.1 CD19多肽设计14
• 2.2 多肽的偶联14
• 2.3 CD19鼠源单克隆抗体的制备14-17
• 2.4 小鼠杂交瘤细胞的抗体基因测序17-21
• 2.5 构建PCD19-CAR-PCDH21
• 2.6 细胞培养21-22
• 2.7 慢病毒包装22-24
• 2.8 慢病毒转染NK-92MI细胞24-25
• 2.9 流式细胞术检测NK-92MI细胞的GFP阳性率25
• 2.10 细胞毒实验25-26
• 结果26-36
• 3.1 筛选获得CD19单克隆抗体26-30
• 3.2 PCD19-CAR修饰的NK-92MI细胞对CD19阳性的B淋巴细胞瘤细胞株的杀伤30-36
• 讨论36-39
• 参考文献39-43
• 综述43-61
• 参考文献54-61
• 硕士学位期间发表的论文61-62
• 缩略词表62-63
• 致谢63-65

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本文编号：1106172