溶血磷脂酸在卵巢癌细胞迁移和增殖中的作用及其分子机理的研究

发布时间：2017-10-29 15:30

  本文关键词：溶血磷脂酸在卵巢癌细胞迁移和增殖中的作用及其分子机理的研究

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【摘要】：溶血磷脂酸(LPA)是一种具有生物活性的磷脂小分子,能够通过细胞膜表面的六个受体(LPA1-6)介导细胞信号转导调节一系列生理药理过程。如,能够参与细胞的增殖、迁移、黏附、凋亡、分化与分泌等,并与伤口愈合、肺纤维化、肿瘤发生与发展等病理过程密切相关。此外,已证实LPA已成为卵巢癌的早期生物标记物,并在患者的腹水内LPA高浓度积累,这对卵巢癌的发展有何作用及其机理是个有趣而未解决的科学问题。所以,本研究在发现LPA能促进卵巢癌细胞的增殖与迁移的基础上阐明了LPA在上述作用中参与的LPA受体亚型,并进一步弄清了其信号通路。研究结果为卵巢癌治疗战略中指出潜在的靶位点。因此,相关研究对于生理活性脂质的调控功能以及与肿瘤发展之间关系等众多的理论和实践方面具有重要意义。实验过程中,我们利用CCK-8法测定细胞增殖、Micro chemotaxis chamber法测定细胞的迁移活性。采用Real Time PCR技术检测人卵巢癌细胞(A2780/HO8910) LPA受体表达谱,发现A2780和H08910中LPA1/LPA3受体优先表达,用药理学方法验证了LPA1/LPA3受体参与细胞增殖和迁移,进一步用RNA干扰技术证明了LPA3是主要的参与受体。用特异性抑制剂确定G偶联蛋白为Gai/o型偶联蛋白。在下游的信号通路研究中,用Western blot测定相关蛋白的表达,MAP激酶的特异性抑制剂确定了参与通路的MAPK类型为p38和ERK,参与的转录因子为NF-kB,而Bcl-2参与抗凋亡过程,同时也测得到MMP参与细胞的迁移机制。结论1、LPA是通过LPA3受体/Gai/o-MAPK-p38/ERK -NF-kB-MMP促进细胞的迁移。2、LPA通过LPA3受体的信号通路促进增殖。我们结果提示,LPA3受体可以作为治疗卵巢癌的一个潜在的靶位点。
【关键词】：LPA3 人卵巢癌细胞 增殖与迁移 信号通路
【学位授予单位】：内蒙古大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.31
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-10
• 英文缩略词表10-11
• 引言11-13
• 第一章 LPA促进卵巢癌细胞A2780和HO8910的增殖和迁移13-23
• 1 材料与方法13-18
• 1.1 材料13-15
• 1.1.1 实验器材13
• 1.1.2 实验材料13
• 1.1.3 实验试剂13-14
• 1.1.4 常用溶剂的配置14-15
• 1.2 方法15-18
• 1.2.1 人卵巢癌细胞A2780和HO8910的培养15-17
• 1.2.1.1 人卵巢癌细胞的复苏15
• 1.2.1.2 人卵巢癌细胞的传代15-16
• 1.2.1.3 人卵巢癌细胞的冻存16-17
• 1.2.2 CCK-8法测定细胞增殖17
• 1.2.3 细胞迁移17-18
• 2 结果与分析18-22
• 2.1 人卵巢癌A2780和HO8910的培养18-19
• 2.2 人卵巢癌细胞A2780和HO8910的细胞标准曲线19-20
• 2.3 LPA刺激能够促进A2780和HO8910细胞迁移20-21
• 2.4 LPA刺激能够促进A2780和HO8910细胞增殖21-22
• 讨论22-23
• 第二章 人卵巢癌细胞A2780/HO8910LPA受体表达情况及相关载体的筛选23-38
• 1 材料与方法23-30
• 1.1 材料23-25
• 1.1.1 实验器材23
• 1.1.2 菌种与质粒23
• 1.1.3 实验试剂23-24
• 1.1.4 常用溶剂的配置24-25
• 1.2 方法25-30
• 1.2.1 Real Time PCR检测A2780和HO8910细胞中LPA受体的mRNA表达25-28
• 1.2.1.1 细胞RNA的提取25
• 1.2.1.2 反转录获取cDNA25-27
• 1.2.1.3 Real Time PCR检测mRNA的表达量27-28
• 1.2.2 摇菌28-29
• 1.2.3 提质粒29
• 1.2.4 脂质体转染实验29-30
• 2 结果与分析30-37
• 2.1 人卵巢癌细胞A2780和HO8910中的LPA受体表达情况30-31
• 2.2 LPA刺激卵巢癌细胞后受体表达变化31-32
• 2.3 转染LPA1/LPA3过表达载体,检测卵巢癌细胞A2780和HO8910内LPA1/LPA3mRNA表达量32-33
• 2.4 转染LPA1/LPA3干扰载体,检测卵巢癌细胞A2780和HO8910内LPA1/LPA3mRNA表达量33-37
• 讨论37-38
• 第三章 探索LPA介导的卵巢癌细胞A2780/HO8910增殖和迁移的信号通路38-64
• 1 材料与方法38-44
• 1.1 材料38-40
• 1.1.1 实验器材38
• 1.1.2 实验药品38
• 1.1.3 实验试剂38-39
• 1.1.4 常用试剂的配制39-40
• 1.1.4.1 1.5 M的Tris-HCl(pH 8.8)的配制39
• 1.1.4.2 1 MTris-HCl的配制39
• 1.1.4.3 5×电泳缓冲液(Running buffer)的配制39
• 1.1.4.4 10×转膜缓冲液(Transfer buffer)的配制39
• 1.1.4.5 TBST Buffer液的配制39-40
• 1.1.4.6 显影液和定影液的配制40
• 1.1.4.7 柠檬酸缓冲液的配置(pH 6.0)40
• 1.2 方法40-44
• 1.2.1 Western Blot实验方法-细胞总蛋白的提取40-42
• 1.2.2 SDS-PAGE浓缩胶和分离胶的配制42
• 1.2.3 Wetern blot实验42-44
• 2 结果与分析44-61
• 2.1 Ki16425抑制LPA促进细胞迁移44-45
• 2.2 shRNA-LPA3能够解除LPA促进细胞迁移的作用45-47
• 2.3 LPA对HO8910细胞MMPs/TIMP的mRNA表达的影响47-48
• 2.4 PTX抑制LPA诱导的细胞迁移48-50
• 2.5 shRNA-LPA3能够解除PTX抑制细胞迁移的作用50-51
• 2.6 SB203580、PD98059抑制LPA促进细胞迁移的影响51-54
• 2.7 BAY抑制LPA促进A2780和HO8910细胞迁移的作用54-57
• 2.8 shRNA-LPA3能够解除LPA促进细胞增殖的作用57-58
• 2.9 LPA能够促进卵巢癌A2780和HO8910细胞Bcl-2表达量的影响升高58-59
• 2.10 EGF抑制剂AG1478对卵巢癌A2780和HO-8910细胞迁移的影响59-61
• 讨论61-64
• 结论64-65
• 1、LPA能够促进卵巢癌细胞的增殖和迁移64
• 2、卵巢癌细胞内LPA1/LPA3高表达64
• 3、LPA是通过LPA3受体/G/n-MAPK-p38/抓K-NF- K B-MMP促进细胞的迁移64
• 4、LPA通过LPA3受体促进卵巢癌细胞的增殖64-65
• 综述 溶血磷脂酸对卵巢癌细胞影响的研究进展65-69
• 参考文献69-74
• 致谢74-75
• 攻读硕士期间发表的学术论文75

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