HBx基因转染SUDHL-4细胞对其生长侵袭的影响

发布时间：2017-10-29 21:10

  本文关键词：HBx基因转染SUDHL-4细胞对其生长侵袭的影响

  更多相关文章： SUDHL-4 HBx 脂质体转染 增殖 侵袭 转移

【摘要】：背景和目的:恶性淋巴瘤(malignant lymphoma,ML)是淋巴造血系统的肿瘤,按照病理类型分为霍奇金淋巴瘤(Hodgkin disease,HL)和非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma,NHL)。在中国,每年新发恶性肿瘤中淋巴瘤约占4%,是九种常见肿瘤中的一种,其在肿瘤导致的死亡排名中居列第十位,其中又以非霍奇金淋巴瘤为主,占ML的85%~90%。弥漫性大B细胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)在组织学形态、遗传学特征、免疫表型及临床表现上都存在着高度的异质性,是NHL中最为常见的一类组织学亚型。临床上发现许多恶性淋巴瘤患者伴有乙型肝炎病毒的感染,两者的关系日益受到相关研究人员的关注。大量临床的研究数据也进一步表明NHL患者乙型肝炎病毒(HBV)感染率明显高于普通人群及其他相关性实体肿瘤的患者,恶性淋巴瘤合并HBV的感染率仅次于肝癌;同时HBV的再激活在NHL合并HBV感染患者的治疗中表现显著,这些研究和发现充分表明HBV病毒感染与淋巴瘤的发生发展存在着一定的相关性。乙型肝炎病毒(HBV)具有S、C、P以及X区4个重叠开放读码框架(ORF),HBV的X基因作为其中最小的ORF,能够编码145个氨基酸组成的蛋白,即HBx。HBx可通过多种不同的作用诱导肝细胞癌(HCC)的形成,并促其发展,其中抑制肝细胞发生凋亡在HBV导致HCC发生的过程中起到巨大的作用。然而,目前的研究和相关报道尚不能解释HBV感染在NHL的发生和进展中的作用及具体机制。因此本实验选用人弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞株SUDHL-4作为研究对象,采用脂质体转染的方法,将HBx基因转入SUDHL-4细胞株中,建立带有乙肝病毒的淋巴瘤细胞模型,研究HBx对B-NHL细胞生长侵袭转移的影响并探讨其可能的作用机制,为筛选有效的治疗药物开辟新的途径,为淋巴瘤合并HBV感染的治疗提供更多有力的理论依据。方法:1、利用分子克隆的方法构建HBx基因的真核载体pcDNA3.1-X。2、将pcDNA3.1-X通过脂质体瞬时转染转入B-NHL细胞SUDHL-4中,构建整合有HBV X基因的淋巴瘤细胞株SUDHL-4-HBx,以SUDHL-4及转染空载体的B-NHL细胞SUDHL-4-con作对照,利用CCK-8法检测转染96h内各组细胞的增殖情况,应用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡情况。3、将pcDNA3.1-X通过脂质体转染法转入SUDHL-4后,用G418筛选稳定转染HBx的SUDHL-4细胞株,取对数期SUDHL-4、SUDHL-4-con和稳定转染的SUDHL-4-HBx细胞,利用CCK8法检测三种细胞96h的生长情况;以SUDHL-4及转染空载体的B-NHL细胞SUDHL-4-con作对照,应用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡情况,用改良噻唑蓝法(MTT)检测细胞粘附力;用Transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭能力。结果:1、重组质粒双酶切结果及质粒测序结果表明成功构建pcDNA3.1-X。2、瞬时转染后SUDHL-4细胞有HBx mRNA的表达,与SUDHL-4组细胞及SUDHL-4-con组细胞相比,SUDHL-4-HBx细胞的增殖减缓,G0/G1期细胞比例增加、S期细胞所占比例减少,细胞凋亡率增加。3、稳定转染HBx基因的SUDHL-4细胞有HBx mRNA及HBx蛋白的表达,与SUDHL-4和SUDHL-4-con组细胞相比,SUDHL-4-HBx细胞的增殖能力、粘附力及转移侵袭能力有不同程度增强;细胞周期无显著变化,细胞凋亡率显著降低。结论:1、成功构建整合有HBV X基因和蛋白的B-NHL细胞株SUDHL-4-HBx。2、瞬时转染HBx基因后,SUDHL-4-HBx细胞的增殖减缓,细胞周期阻滞于G0/G1期,细胞凋亡率增加。3、稳定转染HBx基因后,SUDHL-4-HBx细胞的增殖能力及粘附力、侵袭转移能力均显著增强;细胞凋亡率显著降低。
【关键词】：SUDHL-4 HBx 脂质体转染 增殖 侵袭 转移
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R733.1
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-13
• 缩略词表13-15
• 引言15-16
• 第一部分 HBx基因真核表达载体的构建及鉴定16-30
• 一 材料与仪器16-17
• 1 血清样本16
• 2 试剂与主要耗材16-17
• 3 主要仪器17
• 二 实验方法17-25
• 1 HBV x基因的提取鉴定17-19
• 1.1 乙肝病毒患者血清DNA的提取17-18
• 1.2 HBx基因的PCR扩增18-19
• 1.3 PCR扩增产物的凝胶电泳鉴定19
• 2 HBx基因测序载体构建与鉴定19-22
• 2.1 PCR扩增产物胶回收19-20
• 2.2 紫外分光光度法测DNA浓度20
• 2.3 HBV X基因的克隆20-21
• 2.4 测序质粒的提取21
• 2.5 HBV X基因测序载体的鉴定21-22
• 3 HBx基因真核表达载体构建与鉴定22-25
• 3.1 HBV X基因的酶切及胶回收22-23
• 3.2 T4连接酶连接反应23
• 3.3 转化和培养23-24
• 3.4 重组质粒pcDNA3.1-X的浓度和纯度测定24
• 3.5 重组质粒pcDNA3.1-X的鉴定24-25
• 三 结果25-29
• 1 HBV X基因的凝胶电泳实验结果25
• 2 HBV x基因真核载体鉴定结果25-29
• 四 讨论29-30
• 第二部分 HBx 转染 SUDHL-4 对其生长侵袭转移的影响30-59
• 一 材料与仪器30-32
• 1 细胞株30
• 2 试剂与主要耗材30-31
• 3 主要仪器31-32
• 二 所需溶液的配制32-35
• 1 SUDHL-4 细胞培养所需溶液的配制32-33
• 1.1 含 10%胎牛血清的RPMI-1640培养液32
• 1.2 台盼蓝染液32-33
• 1.3 PBS缓冲溶液33
• 1.4 细胞冻存液33
• 2 转染后细胞粘附、迁移及侵袭实验所需溶液的配制33-34
• 2.1 MTT溶液33
• 2.2 FN溶液33
• 2.3 BSA溶液33
• 2.4 结晶紫溶液33-34
• 3 Western Bolt实验所需溶液的配制34-35
• 3.1 电泳缓冲液34
• 3.2 电转缓冲液34
• 3.3 5×SDS loading buffer上样缓冲液34
• 3.4 TBST缓冲液34
• 3.5 封闭液34
• 3.6 丽春红染色液34-35
• 三 实验方法35-46
• 1 细胞的复苏、培养及冻存35-36
• 1.1 细胞复苏35
• 1.2 细胞培养35
• 1.3 细胞传代35
• 1.4 细胞冻存35-36
• 1.5 单细胞悬液制备和细胞计数36
• 2 细胞转染36-37
• 2.1 G418筛选剂量确定36
• 2.2 脂质体转染36-37
• 2.3 稳定表达HBx基因SUDHL-4 细胞株的筛选37
• 3 瞬时转染HBx基因对SUDHL-4 细胞凋亡的影响37-41
• 3.1 SUDHL-4 细胞转染后形态变化及转染情况37
• 3.2 瞬时转染SUDHL-4 细胞中HBx基因的表达37-39
• 3.3 瞬时转染HBx基因对SUDHL-4 细胞增殖的影响39-40
• 3.4 瞬时转染HBx基因对SUDHL-4 细胞周期和凋亡率的影响40-41
• 4 稳定表达HBx基因对SUDHL-4 细胞生物学特性的影响41-46
• 4.1 RT-PCR验证SUDHL4HBx细胞株中HBx mRNA的表达41
• 4.2 Western Bolt验证SUDHL4HBx细胞中HBx蛋白的表达41-44
• 4.3 稳定表达HBx基因对SUDHL-4 细胞增殖的影响44
• 4.4 稳定表达HBx基因对SUDHL-4 细胞周期和凋亡的影响44
• 4.5 稳定表达HBx基因对SUDHL-4 细胞粘附力、迁移力及侵袭力的影响44-46
• 4.6 数据分析46
• 四 结果46-56
• 1 SUDHL-4 细胞瞬时转染 HBx 后形态变化及转染情况46-47
• 2 RT-PCR测定瞬时转染HBx基因mRNA的表达47-48
• 3 瞬时转染HBx基因对SUDHL-4 细胞增殖的影响48-49
• 4 瞬时转染HBx基因对细胞周期和细胞凋亡的影响49-50
• 5 稳定表达HBx基因SUDHL-4 细胞株的鉴定50-51
• 6 稳定表达HBx基因对SUDHL-4 细胞增殖的影响51-52
• 7 稳定表达HBx基因对SUDHL-4 细胞周期和凋亡的影响52-53
• 8 稳定表达HBx基因对SUDHL-4 细胞粘附力的影响53-54
• 9 稳定表达HBx基因对SUDHL-4 细胞转移和侵袭的影响54-56
• 五 讨论56-58
• 六 结论58-59
• 参考文献59-62
• 综述62-78
• 参考文献72-78
• 个人简介78-79
• 致谢79

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 张玉勤;;细胞分化再活化治疗肿瘤[J];国外医学情报;1991年01期

2 David　Tenenbaum,饶新华;细胞之源[J];世界科学;2000年11期

3 闫贵新;干细胞研究的重大进展[J];畜牧兽医科技信息;2000年11期

4 赵志力;付小兵;;正常与异常的细胞分化[J];感染.炎症.修复;2001年03期

5 赵志力;付小兵;;修复细胞分化的调控机制与鉴别[J];感染.炎症.修复;2001年04期

6 赵志力;修复细胞分化的调控机制与鉴别[J];中国危重病急救医学;2002年02期

7 赵志力;付小兵;;不同发育阶段细胞的分化与调控机制[J];感染.炎症.修复;2002年01期

8 戴新贵;姚咏明;艾宇航;;辅助性T细胞17的研究进展[J];生理科学进展;2008年04期

9 ;细胞分化:一个两阶段的过程[J];中华妇幼临床医学杂志;2009年02期

10 黄绍勤;曹惠珍;;生命的基本单位——细胞[J];广医通讯;1980年03期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 徐志彦;;《细胞分化》教学案例(教学内容安排1课时)[A];河北省教师教育学会第二届中小学教师教学案例展论文集[C];2013年

2 尹青;张雷;李莉;谢丹丹;龚淼;;体外心肌样环境对P19细胞向心肌细胞分化的诱导作用[A];中国解剖学会2012年年会论文文摘汇编[C];2012年

3 丁建东;;图案化表面与干细胞分化[A];2013年全国高分子学术论文报告会论文摘要集——大会邀请报告[C];2013年

4 陈思;黄欣;陈少华;杨力建;郑海涛;李扬秋;;BCL11B基因在T细胞分化和增殖中调节作用的研究[A];中国病理生理学会第九届全国代表大会及学术会议论文摘要[C];2010年

5 江键;崔黎丽;宋诚荣;王小平;宋茂海;;负极性驻极体诱导3T3细胞表面电荷和游离钙浓度的变化[A];第四届中国功能材料及其应用学术会议论文集[C];2001年

6 梁冀;于会梅;傅继东;郭昂;杨黄恬;;内质网钙离子释放受体对干细胞分化的调控[A];中国病理生理学会受体、肿瘤和免疫专业委员会联合学术会议论文汇编[C];2010年

7 罗家江;;TH17细胞的研究进展[A];全国中西医结合血液学学术会议论文汇编[C];2010年

8 项盈;金洁;沈丹;郑强;谢纯刚;贾冰冰;黄国平;王金福;;复苏的人骨髓间充质干细胞的分离、培养及向多系细胞分化的诱导[A];第10届全国实验血液学会议论文摘要汇编[C];2005年

9 汪洋;朱椰凡;余华军;符竣惠;徐启纲;曾其强;吴建波;张启瑜;;三种全肝脏去细胞化流程对细胞外基质的影响及细胞组分残留量的研究[A];2013年浙江省外科学学术年会论文汇编[C];2013年

10 常平安;陈瑞;李薇;伍一军;;神经病靶标酯酶的增强表达抑制哺乳动物细胞的增殖[A];中国环境诱变剂学会抗诱变剂和抗癌剂专业委员会第三次全国学术会议、中国毒理学会生化与分子毒理专业委员会第五届学术交流会、贵州省环境诱变剂学会成立大会暨首届学术交流会论文集[C];2004年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 徐荣祥;人类生命细胞 再生物质的发现与研究[N];健康报;2007年

2 张佳星;干细胞分化路径存在差异性[N];中国矿业报;2008年

3 史军;剥开黏合的细胞之书[N];健康报;2012年

4 常丽君;美生物学家打造出“细胞黑客”[N];科技日报;2010年

5 张佳星;分化之路 殊途同归[N];科技日报;2008年

6 记者 施嘉奇　通讯员 王姿英;探索中药对干细胞分化的作用[N];文汇报;2009年

7 记者陈超;日开发细胞间隔离培养技术[N];科技日报;2003年

8 陈超;科学家发现引发细胞分化的分子通道[N];科技日报;2010年

9 记者 白毅;我国科学家用iPS细胞首获克隆猪[N];中国医药报;2013年

10 记者 钱铮;日本用人类iPS细胞首次制成血小板[N];新华每日电讯;2009年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 唐绍灿;IL-27、Th1及Th17细胞在MS中的表达及其作用机制研究[D];山东大学;2015年

2 常凯凯;子宫内膜异位灶微环境IL-10~+Th17细胞的形成及作用机制[D];复旦大学;2014年

3 高华嵩;细胞重编程技术和移植治疗视神经损伤的实验研究[D];复旦大学;2014年

4 李艳明;Hsa-miR-200a调控红细胞分化的功能及分子机制研究[D];中国科学院北京基因组研究所;2015年

5 张林;C-反应蛋白通过对T细胞分化的直接调控参与后天免疫应答[D];兰州大学;2015年

6 蒋云秋;树突状细胞Notch信号在1，25-二羟维生素D3调节Th17分化中的作用研究[D];第三军医大学;2015年

7 史莉瑾;急性脑出血患者外周血调节性T细胞与脑相关抗原的特征及其相关性研究[D];郑州大学;2015年

8 陈博;可注射细胞微球明胶复合物联合血小板裂解液在牙组织工程中的应用研究[D];第四军医大学;2015年

9 章丽雅;血红素加氧酶-1调抑Th17细胞在炎症性肠病中的作用及机制研究[D];上海交通大学;2013年

10 曹际森;miR-146a调控Treg细胞抑制小鼠心脏移植免疫排斥的研究[D];天津医科大学;2015年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 周明;As_2O_3联合γ分泌酶抑制剂影响肝癌HepG_2细胞耐药性的研究[D];石河子大学;2015年

2 刘冰慧;凋亡细胞对巨噬细胞IL-12家族细胞因子调控的研究[D];河北医科大学;2015年

3 韩青青;Th22细胞及其效应因子IL-22与类风湿关节炎及合并间质性肺病相关性的研究[D];河北医科大学;2015年

4 张腾飞;吉西他滨与AMD3100联合应用于胆管癌RBE细胞株对CXCR4/CXCL12轴的作用[D];河北医科大学;2015年

5 王們X ;EAAL细胞联合全反式维甲酸对人肺腺癌细胞株A549体内外作用的研究[D];河北医科大学;2015年

6 李超楠;两种典型OPFRs对PC12细胞的神经毒性及其机制探究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2015年

7 杨明;促肾上腺皮质激素释放因子1型受体经cAMP/PKA信号通路对U87MG细胞凋亡机制的研究[D];河北医科大学;2015年

8 周新宇;miR143、miR145对C2C12细胞分化的影响作用研究[D];四川农业大学;2015年

9 李姝;淫羊藿苷对胃癌SGC-7901细胞内CaSR及Survivin、Runx3基因表达的影响[D];甘肃中医药大学;2016年

10 金瑛;体外诱导人羊膜间充质干细胞向韧带细胞分化的实验研究[D];遵义医学院;2016年

，

本文编号：1114664