HMGB1表达下调对胃癌细胞生物学功能的影响及初步分子机制探讨

发布时间：2017-10-30 09:00

  本文关键词：HMGB1表达下调对胃癌细胞生物学功能的影响及初步分子机制探讨

  更多相关文章： 高迁移率族蛋白1 胃癌 增殖 迁移 凋亡 生物学功能 信号通路

【摘要】：研究背景1973年,一组在电泳下具有高迁移率的非组蛋白核蛋白被发现并且被命名为高迁移率族(high-mobility group HMG)蛋白,高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein HMGB1)是其中含量最丰富并且研究最充分的HMG蛋白。HMGB1在多种人类疾病中,尤其是在肿瘤及炎症性疾病中扮演重要角色。HMGB1在胞内不仅是DNA分子伴侣、染色体监管者、细胞自噬维持者、凋亡细胞的保护者,并且在细胞外HMGB1可以发挥细胞因子,趋化因子和生长因子活性,参与炎症和免疫应答反应。HMGB1功能缺陷与肿瘤演进的每一种标志均相关,并且在肿瘤的发生及发展中发挥作用。HMGB1的这些特征使其成为肿瘤研究中的重要分子靶点。尽管如此,目前在胃癌中HMGB1的生物学作用及其分子机制仍知之甚少。目的检测慢病毒载体干扰HMGB1表达后,胃癌细胞系SGC-7901的生物学活性,利用基因芯片技术筛选潜在下游作用因子,并进行Western blot实验初步验证。方法针对4个HMGB1靶点序列设计特异性干扰sh RNA小分子(HMGB1-sh RNA1,HMGB1-sh RNA 2,HMGB1-sh RNA 3,HMGB1-sh RNA 4),分别构建慢病毒转染载体GV115-HMGB1-KD1(KD1)、GV115-HMGB1-KD2(KD2)、GV115-HMGB1-KD3(KD3)、GV115-HMGB1-KD4(KD4),并构建阴性对照载体GV115-HMGB1-NC(NC)。分别通过Lipofectamine 2000转染SGC-7901细胞。RT-PCR和Western blot检测转染后HMGB1的表达。胃癌细胞的生物学行为通过下述实验方法分析:MTT实验和Brd U实验检测增殖,克隆形成实验检测克隆数,流式细胞实验检测细胞周期和凋亡。Transwell实验检测迁移。用敲减组及阴性病毒对照组通过基因芯片技术探索下游基因。选择下游信号通路并进行进一步分析。结果RT-PCR示KD1、KD2、KD4显著抑制HMGB1的表达(75%),KD2组抑制效率最高。Western blot实验证实相对于阴性病毒对照组(NC)和空白细胞对照组(CON),KD2组HMGB1表达显著抑制(P0.05)。MTT实验和Brd U实验证实了与CON组和NC组相比,KD2组显著抑制细胞增殖(P0.05)。克隆形成实验示KD2组较NC组细胞克隆数减少(P0.05)。Transwell实验显示KD2组相对CON组和NC组细胞迁移率受到显著抑制(P0.05)。相对NC组,KD2组的细胞凋亡率显著增加。流式细胞实验证实了KD2组的S期细胞较NC组细胞数量减少(P0.05)。基因芯片分析证实了通过抑制HMGB1在胃癌细胞中的表达778种基因上调,587种基因下调。生物信息学分析表明HMGB1可能在胃癌细胞中通过调节MAPK信号通路中的RAC1、IL1A、TGFBR2、AKT2、DUSP5、MAPK9(JNK2)等因子的表达发挥其生物学作用。结论HMGB1干扰慢病毒载体构建成功,通过该载体我们得到稳定的HMGB1低表达胃癌细胞,下调HMGB1可以抑制细胞增殖,克隆形成和迁移,增加细胞凋亡。在胃癌中HMGB1可能通过调控MAPK通路中的RAC1、IL1A、TGFBR2、AKT2、DUSP5、MAPK9(JNK2)等分子发挥生物学作用。
【关键词】：高迁移率族蛋白1 胃癌 增殖 迁移 凋亡 生物学功能 信号通路
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.2
【目录】：

• 缩略语表6-8
• 中文摘要8-10
• 英文摘要10-13
• 前言13-14
• 文献回顾14-24
• 1 胃癌的研究背景14
• 2 HMGB1 研究背景14-21
• 3 HMGB1 与肿瘤研究现状21-22
• 4 HMGB1 与胃癌的研究现状22
• 5 本实验的研究目的及意义22-24
• 实验一 HMGB1表达下调胃癌细胞系的建立及鉴定24-37
• 1 材料24-26
• 1.1 细胞系与质粒24
• 1.2 主要试剂和仪器24-26
• 2 方法26-32
• 2.1 HMGB1基因RNAi慢病毒载体的构建26-28
• 2.2 慢病毒小量包装及其滴度测定28-29
• 2.3 胃癌细胞慢病毒感染29-31
• 2.4 RT-PCR内源筛选有效靶点31-32
• 2.5 Western blot实验检测HMGB1蛋白表达32
• 3 结果32-35
• 3.1 慢病毒干扰载体GV155HMGB1阳性克隆PCR鉴定32-33
• 3.2 慢病毒干扰载体GV155HMGB1的DNA测序结果33
• 3.3 慢病毒包装与病毒滴度测定33-34
• 3.4 RT-PCR内源筛靶结果34-35
• 3.5 Western blot验证结果35
• 4 讨论35-37
• 实验二 HMGB1表达下调对胃癌细胞生物学功能的影响37-46
• 1 材料37-38
• 1.1 研究对象37
• 1.2 主要试剂和仪器37-38
• 2 方法38-40
• 2.1 胃癌细胞慢病毒感染38
• 2.2 MTT实验38
• 2.3 Brd U掺入实验38-39
• 2.4 克隆形成实验39
• 2.5 凋亡实验（Annexin V-APC单染法）39
• 2.6 细胞周期检测39-40
• 2.7 Transwell实验40
• 2.8 统计学处理40
• 3 结果40-45
• 3.1 HMGB1表达下调胃癌细胞的增殖显著降低40-42
• 3.2 HMGB1表达下调胃癌细胞的克隆形率显著降低42
• 3.3 HMGB1表达下调胃癌细胞的凋亡数增多42-43
• 3.4 HMGB1表达下调胃癌细胞的S期细胞数明显减少43-44
• 3.5 HMGB1表达下调胃癌细胞的迁移率降低44-45
• 4 讨论45-46
• 实验三 HMGB1表达下调胃癌细胞Affymetrix芯片检测分析46-57
• 1 实验材料46-47
• 1.1 研究对象46
• 1.2 主要试剂和仪器46-47
• 2 方法47-48
• 2.1 样本总RNA质检47
• 2.2 3’IVT反应47-48
• 2.3 杂交48
• 2.4 洗染及扫描48
• 2.5 标准化方法及软件48
• 2.6 Western blot实验验证下游基因48
• 3 结果48-55
• 3.1 质检结果48-49
• 3.2 有显著差异表现的基因数目及目的基因表现。49-50
• 3.3 聚类图50
• 3.4 火山图50-51
• 3.5 散点图51-52
• 3.6 Pathway分析52-53
• 3.7 深入分析结果53
• 3.8 下游基因Western blot验证53-55
• 4 讨论55-57
• 小结57-59
• 参考文献59-69
• 个人简历和研究成果69-70
• 致谢70

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