TGF-β诱导Treg细胞极化进而调控肝细胞癌的发展

发布时间：2017-10-30 09:15

  本文关键词：TGF-β诱导Treg细胞极化进而调控肝细胞癌的发展

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【摘要】：研究背景和目的：肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,其发病率位居第三,每年死亡的病例数超过50万。因其恶性程度高,预后差,素有癌中之王的称号。随着肝癌研究的发展及其治疗手段的不断更新,临床上肝癌的疗效取得了一定提高。但大多数肝癌患者确诊时已是中晚期,常错失手术时机,手术切除率仅有20-30%,而常规放化疗敏感性较差,且肝癌术后复发转移率高,这些因素使得肝癌患者的预后仍不尽人意。统计资料显示,肝癌术后5年复发率达70%,复发转移已经成为进一步提高肝癌远期疗效的最大障碍,也是攻克肝癌的关键问题之一。前期对于肝癌的研究重点主要集中于基因突变方面,比如原癌基因的激活或抑癌基因的失活等,希望找到在肝癌发生发展中起着决定性作用的节点分子,同时也希望像其他肿瘤一样给临床上肝癌一个详细的分型。由于肝癌的异质性,目前这方面的研究不如人意。近期一些研究发现,免疫微环境在HCC的发生发展过程中同样发挥着重要作用,相关肿瘤浸润免疫细胞如Treg细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和Th17细胞等在肝癌的发生发展中具有重要的重用,可通过分泌相关炎性因子作用于肿瘤细胞起促进或抑制作用。Treg细胞对维持免疫微环境的稳定具有重要作用,并参与外周免疫耐受的维持以及防止自身免疫反应的发生,其主要的标志物是Foxp3。相关研究表明,肿瘤组织中浸润的Treg细胞对宿主的免疫应答起着抑制作用,因此其在肿瘤的治疗中起着负面效应。TGF-β主要是有活化的巨噬细胞分泌,一些受损伤的肝细胞也能分泌少量的TGF-p,可通过作用于TGF-β受体后激活下游的smad2/3,促进smad2/3的入核,在肝癌的发生发展中起着重要的作用。相关研究表明TGF-β参与了CD4+自然T细胞分化成为Treg细胞的过程,其在宿主免疫应答以及免疫耐受的调控过程中也发挥重要作用。前期研究表明,TGF-β可以诱导TCR缺陷的CD4+CD25-自然T细胞中Foxp3的表达,导致外周CD4+CD25-自然T细胞向CD4+CD25-Treg细胞分化,具有强大的免疫抑制潜能。此外,研究还发现TGF-β在人类外周血Treg细胞的传代和扩增过程中同样发挥着重要作用。SM-16是特异性的TGF-β一型受体抑制剂,相关研究发现SM-16可通过阻断TGF-β通路抑制肝纤维化的进展,然而SM-16在肝癌中的作用并未见报道。因此,本课题将通过TGF-β一型受体抑制剂SM-16研究TGF-β在肝癌进展中对Treg细胞的作用,并结合临床相关样本分析TGF-p与IL10的相关性。研究方法：将小鼠随机分为三组,即健康小鼠组、DEN小鼠组以及DEN+SM-16阻断小鼠组。研究健康小鼠组、DEN小鼠组以及DEN+SM-16小鼠组中HCC的发展过程、TGF-β以及Foxp3表达水平、血清中TGF-β的水平、血清中IL-10的水平、血清中GP73的水平和Treg细胞的比例。在体外通过流式细胞检测实验分析TGF-β在Treg细胞极化过程中的作用。通过免疫组化的方式鉴定HCC患者肿瘤样本中TGF-β以及IL-10的表达水平,并分析两者的相关性。研究结果：1.在DEN诱导的HCC小鼠模型中,我们证明了SM-16能否成功阻断TGF-β。2.我们于不同的时间段处死三组小鼠,并取得其肝脏组织。PCR结果显示DEN小鼠组的TGF-β表达水平显著高于另外两组。而ELISA的结果显示DEN小鼠组外周血中TGF-p的蛋白浓度显著高于另外两组。在蛋白水平,通过western blot检测,我们同样发现DEN小鼠组的肝脏组织中TGF-β的蛋白水平也明显高于其他两组。3.通过HE染色观察三组小鼠肝脏的组织学变化,发现DEN小鼠组的肝脏损伤明显较另外两组严重,表现为肝组织致密且出现大量中性粒细胞浸润。DEN+SM-16小鼠组的损伤程度与健康组大体相当。可见,TGF-β阻断后对肝脏可起到一定的保护作用。4.从生物指标的角度来看,GP73是一种常见的肝癌早期血清标志物,我们通过Elisa检测其血清含量,发现DEN+SM-16组的GP73血清含量明显低于肝癌组,证明了SM-16处理后,肝癌的恶性程度下降了。5.我们通过流式检测了三组小鼠脾脏中CD4T细胞四种亚型相关基因Th1、Th2、Th17以及Treg细胞的表达。结果发现Treg细胞在TGF-β阻断前后发生了明显的变化,而其余的细胞均保持稳定。6.在转录水平检测了Treg细胞相关基因Foxp3的表达。在血清中,我们又利用ELISA检测Treg细胞效应分子IL-10的蛋白浓度。发现两者在DEN小鼠组中的表达明显高于其他两组。7.我们对所得的结果进行了临床样品的验证。提取不同分期肝癌组织样本的RNA进行转录分析。发现TGF-β与IL-10的表达与肝癌的进展呈正相关。此外,我们对TGF-β以及IL-10的表达进行了相关性分析,发现两者在肝癌患者组织样本中高度相关。结论：本项研究证实SM-16对小鼠DEN诱导肝癌模型中的TGF-β具有抑制作用,可在核酸及蛋白水平下调TGF-β的表达,并能抑制小鼠血清中TGF-β的分泌。同时也证实了SM-16可以抑制肝癌的进展及恶性程度。相关检测发现SM-16可以降低Treg细胞的比例。临床相关研究证实肝癌组织中TGF-β与IL10呈相关性。综上所述,TGF-β可以通过诱导Treg细胞的极化而促进肝癌的进展。
【关键词】：肝细胞癌 TGF-β Treg细胞 IL10
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 摘要6-9
• ABSTRACT9-13
• 缩略词表13-14
• 引言14-15
• 材料和方法15-26
• 一、材料15-18
• (一) 主要化学和生物试剂15
• (二) 载体、菌株和抗体15-16
• (三) 实验动物16
• (四) 主要缓冲液16-18
• 二、仪器设备18-19
• 三、实验方法19-26
• (一) 动物模型19
• (二) 免疫印记(Western Blot)19-21
• (三) 实时荧光定量PCR(Real-time PCR)21-22
• (四) 细胞流式分析(Fluorescence activated cell sorting)22
• (五) 血浆细胞因子测定22
• (六) 免疫组织化学22-23
• (七) HE染色23-24
• (八) 免疫组化图片软件评分24-25
• (九) 统计学分析25-26
• 结果26-37
• 讨论37-39
• 结论39-40
• 参考文献40-43
• 文献综述143-51
• 摘要43
• 引言43-47
• 小结47-48
• 参考文献48-51
• 文献综述251-58
• 摘要51
• 引言51-52
• IGF在肝癌发生过程中的分子机制52-54
• 展望54-55
• 参考文献55-58
• 文献综述358-67
• 摘要58-59
• 引言59-64
• 结论64-65
• 参考文献65-67
• 发表论文和科研工作情况说明67-69
• 附件69-78
• 致谢78-82

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本文编号：1117042