LITAF基因在B细胞淋巴瘤发病机制中的生物学功能研究

发布时间：2017-10-31 09:28

  本文关键词：LITAF基因在B细胞淋巴瘤发病机制中的生物学功能研究

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【摘要】：LITAF (LPS-induced TNF a factor),作为一种转录因子,在LPS刺激下可以特异性地识别TNF-a启动子区的CTCCC序列,调控其转录表达,从而在炎症反应过程中起着重要的调节作用。最初发现LITAF基因在P53诱导细胞凋亡的模型中显著上调。近年来,不断有研究表明LITAF可能作为一个抑癌基因在多种人类肿瘤中发挥作用。研究发现,在成熟型B细胞淋巴瘤中,LITAF基因的启动子区存在高甲基化,而对照样本中均未检测到异常甲基化,其在B细胞淋巴瘤中的生物学功能仍不清楚。我们知道B细胞淋巴瘤在生物学行为和临床预后有显著的异质性,寻找新的分子靶点成为当前研究的热点。本研究旨在探索LITAF基因对B细胞淋巴瘤的增殖、凋亡和分化发育可能存在的调控作用。 首先,对本实验室的6株B细胞淋巴瘤细胞株进行LITAF表达水平的检测,筛选出4株作为过表达或敲低的模型细胞。根据检测结果,构建LITAF的慢病毒过表达载体(LITAF-pLVX-IRES-ZsGreen1)感染Burkitt's淋巴瘤细胞Ramos和DLBCL细胞OCI-Ly6。另外,构建LITAF的慢病毒敲低载体(LITAF-pLKO.1-puro)感染Burkitt's淋巴瘤细胞Namalwa和DLBCL细胞OCI-Ly3细胞株。通过流式细胞仪检测细胞凋亡实验,发现LITAF过表达,可以诱导细胞凋亡,且过表达BCL6可逆转由其介导的细胞凋亡。另一方面,LITAF被敲低后,经饥饿和双氧水处理诱导细胞凋亡,与对照组相比,其凋亡率显著下降。Western blotting的结果显示,LITAF过表达后激活了线粒体途径,Bax上调,促进了细胞色素C释放到线粒体外,剪切PARP,诱导细胞凋亡。通过细胞周期和MTT实验,发现LITAF可以抑制细胞增殖,减慢细胞周期进程。同时,抑制NF-κB信号通路相关基因的表达水平。最后,检测LITAF对B淋巴细胞增殖、存活、分化发育中的重要基因BCL6、Blimp1和C-myc的调节作用。研究发现,LITAF和BCL6在B细胞淋巴瘤细胞株中的表达呈负相关。过表达LITAF后能显著降低BCL6的mRNA水平,而在其敲低后,BCL6的mRNA水平显著升高。荧光素酶报告基因实验结果表明,LITAF能结合到BCL6基因的启动子区,并抑制其转录水平。我们通过免疫共沉淀,发现两者的蛋白产物相互结合。并且,免疫荧光显示,LITAF存在入核现象,其可能与细胞核内的BCL6存在相互作用。此外,Blimp1作为BCL6的下游靶基因,两者相互抑制,本研究发现,LITAF过表达后,Blimp1的表达上调。而在LITAF敲低后,Blimp1的表达水平也伴随着下调。而C-myc作为Blimp1的经典下游基因,同样受到LITAF的调节作用,过表达LITAF可以抑制C-myc的表达,而在敲低其表达后,C-myc的表达显著上调。 综上所述,LITAF可能作为一个抑癌基因调控细胞的增殖、凋亡和分化。文献报道在B-NHL中LITAF启动子区高甲基化,导致基因沉默,其可能与B细胞淋巴瘤的发生发展密切相关。本研究中,我们通过过表达和敲低LITAF的分子技术,研究了B-NHL细胞的凋亡、增殖和分化相关基因的表达水平变化。LITAF基因可能主要通过抑制原癌基因BCL6的表达和NF-κB信号通路活性,从而抑制细胞增殖,同时激活线粒体途径诱导细胞凋亡。另外,通过调节BCL6下游基因Blimp1和C-myc的表达水平,从而影响B淋巴细胞的分化。当然,这其中的分子机制仍有待进一步的研究。最后,本研究将继续收集临床样本,在病例组织学上通过免疫组织化学的方法揭示以上研究结果在B-NHL各个亚型发病中的作用和实际分子机制。本研究希望能为B细胞淋巴瘤的临床诊断和靶向治疗提供可能的新的分子靶点。
【关键词】：B细胞淋巴瘤 LITAF BCL6 凋亡
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R733.1
【目录】：

• 致谢5-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-11
• 缩略词表11-13
• 目次13-15
• 1 前言15-19
• 2 主要的仪器设备和试剂19-23
• 2.1 仪器设备19-20
• 2.2 主要生化试剂20-23
• 3 缓冲液和培养液的配制方法23-30
• 3.1 核酸凝胶电泳缓冲液23
• 3.2 Western Blot缓冲液23-26
• 3.3 分子克隆缓冲液26-28
• 3.4 免疫荧光缓冲液28
• 3.5 细胞培养液28-30
• 4 实验方法30-46
• 5 结果46-63
• 6 讨论63-67
• 7 结论67-68
• 8 参考文献68-73
• 9 综述73-87
• 参考文献80-87
• 10 作者简历及在读期间所取得科研成果87-88

【共引文献】

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本文编号：1121766