吖啶橙荧光染色法检测肾癌循环肿瘤细胞及其临床意义

发布时间：2017-10-31 10:29

  本文关键词：吖啶橙荧光染色法检测肾癌循环肿瘤细胞及其临床意义

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【摘要】：目的应用吖啶橙荧光染色法(acridine orange fluorescent,AO-F)搭建循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)筛选平台,并将其应用于肾癌患者外周血CTCs筛查,评估其在肾癌患者中的临床价值。方法1、培养肾癌组织原代细胞和肿瘤细胞株769-P,AO-F法染色后加盖片于荧光显微镜下观察细胞形态及着色情况。分别制备死亡肿瘤细胞(75℃水浴30min)和活肿瘤细胞(加新鲜PBS放置30min)。AO-F染色后分别计数5个随机视野下两组细胞中AO-F+细胞所占的比例,评估AO-F染料对肿瘤细胞的敏感性。2、抽取健康体检者肘正中静脉血5 ml,红细胞裂解液法富集单个核细胞,PBS逐级稀释,配制为含106个单个核细胞的细胞悬液于玻璃管中,共20管。将不同数量的769-P细胞(500、200、100、50、10个/管)与106个单个核细胞混合以模拟肾癌患者外周血CTCs模型,AO-F染色后计算各组肿瘤细胞回收率,验证该方法敏感性和可重复性。3、使用上述方法检测139例肾癌患者(112例早期患者和27例转移患者)、10例良性肾病患者外周血中CTCs的表达水平。并分析10例健康志愿者的外周血样,评估此方法的特异性。4、分析CTCs表达水平与患者性别、年龄、肿瘤大小、病理类型、T分类、furhman分级、是否转移等临床病理参数之间的关系。结果1、肾癌组织原代细胞和肿瘤细胞株的形态和着色情况无明显差异。活肿瘤细胞组呈现典型的AO-F+细胞特性,而死亡肿瘤细胞组却未能呈现出相应特征。平均每个视野下AO-F+细胞占肿瘤细胞的比例为93%±3%,吖啶橙染料与肿瘤细胞具有较高敏感性。2、含500、200、100、50个肿瘤细胞的悬液组肿瘤细胞回收率(%)分别为:10.2±3.8、9.2±2.3、10.8±2.6、10.5±1.9,组间差异无统计学意义(F=1.001,P0.05)。4组敏感性实验肿瘤细胞平均回收率为10.16±2.73%。含10个细胞的悬液组偶然可测到AO-F+细胞。加入的肿瘤细胞越多,检出的AO-F+细胞数越多,两者间存在Pearson正相关(Pearson=0.959,P=0.00)。3、139例肾癌患者中19例(19/139,13.67%)可检测到CTCs,早期和转移患者分别为10例(10/112,8.93%)和9例(9/27,33.33%)。10例健康志愿者、10例良性肾病患者均未检测到CTCs。4、总体检出水平与患者年龄、性别、肿瘤大小、病理类型、T分类、Furhman分级均未见相关性(P0.05),但与患者是否转移有明显相关(P0.05)。早期患者和转移患者的检出情况与临床病理参数之间均未发现统计学差异(P0.05)。5、在早期患者和转移患者之间,阳性检出率在患者年龄、性别、肿瘤大小、T分类(T 2/3)、Furhman分级之间均未发现统计学差异(P0.05)。但在T1有统计学差异(P0.05)。结论证实了吖啶橙染料对肿瘤细胞具有较高敏感性,AO-F染色法筛查外周血CTCs切实可行,并具有较高的可重复性和特异性。CTCs可作为预测肾癌患者是否发生转移的一个重要指标,对早期预测肾癌复发转移有一定参考价值,值得进一步探索。
【关键词】：循环肿瘤细胞 吖啶橙荧光染色 肾癌 阳性率 检测
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.11
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 符号说明10-11
• 前言11-13
• 一、吖啶橙荧光染色技术检测CTCs方法的建立13-29
• 1.1 材料和方法13-19
• 1.1.1 主要试剂13-14
• 1.1.2 仪器14
• 1.1.3 主要溶液的配制14-15
• 1.1.4 肾癌组织原代细胞、肿瘤细胞株及健康人外周血15
• 1.1.5 细胞培养15-18
• 1.1.6 模拟肾癌患者外周血循环肿瘤细胞18-19
• 1.1.7 吖啶橙荧光染色19
• 1.1.8 统计学方法19
• 1.2 结果19-23
• 1.2.1 肾癌细胞原代培养19-20
• 1.2.2 原代肿瘤细胞与肿瘤细胞系AO-F染色对比20-21
• 1.2.3 活肿瘤细胞和死亡肿瘤细胞AO-F染色21
• 1.2.4 AO染料对肿瘤细胞敏感性21-22
• 1.2.5 模拟患者外周血CTCs模型中肿瘤细胞回收率22-23
• 1.3 讨论23-28
• 1.4 小结28-29
• 二、吖啶橙荧光检测法筛查肾癌患者CTCs29-45
• 2.1 对象和方法29-32
• 2.1.1 主要仪器和试剂29
• 2.1.2 研究对象29
• 2.1.3 国际抗癌协会分期和分级标准29-31
• 2.1.4 患者外周血采集、CTCs检测及临床资料的随访31
• 2.1.5 吖啶橙检测法的诊断标准31-32
• 2.1.6 统计方法32
• 2.2 结果32-39
• 2.2.1 肿瘤组织印片AO-F染色32-33
• 2.2.2 肾癌患者外周血AO-F染色33-35
• 2.2.3 139例患者临床病理资料35
• 2.2.4 肾癌患者外周血CTCs检出情况与临床病理参数之间关系35-37
• 2.2.5 112例早期肾癌患者CTCs检出率与临床病理参数之间关系37-38
• 2.2.6 27例转移肾癌患者CTCs检出率与临床病理参数之间关系38-39
• 2.2.7 早期肾癌患者与转移肾癌CTCs的检出与临床病理的关系39
• 2.3 讨论39-44
• 2.4 小结44-45
• 结论45-46
• 参考文献46-52
• 发表论文和参加科研情况说明52-53
• 综述53-67
• 综述参考文献61-67
• 致谢67

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 王礼泉;王玉华;崔进贝;;循环肿瘤细胞计数在肾癌患者的临床应用研究[J];中国现代医生;2010年33期

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本文编号：1121980