Spred-2与Rab11相互作用影响大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤细胞PC12分化

发布时间：2017-10-31 16:01

  本文关键词：Spred-2与Rab11相互作用影响大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤细胞PC12分化

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【摘要】：Spred (Sprouty related with EVH1 domain)蛋白家族是一类酪氨酸激酶结合蛋白。Spred蛋白由三个结构域组成,分别为：N端EVH-1结构域,中央KBD结构域和C端SPR结构域。目前哺乳动物中发现的Spred蛋白家族成员主要为Spred-1、Spred-2、Spred-3和Eve-3。 Spred-3缺少KBD结构域,Eve-3仅含有EVH-1结构域。Spred特异性抑制多种生长因子诱导的Ras/Raf/Erk信号通路活化,抑制细胞分化,但具体机制复杂,有待进一步阐明。Spred2在不同腺体和分泌组织中均有较高表达,主要定位于细胞内囊泡状结构,与循环内吞体标志蛋白Rab11共定位。Rab11参与细胞内囊泡运输,促进神经突生长。我们之前的研究及其他研究均表明,Spred-2抑制大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤细胞PC12分化,但机制不明。我们推测Rab11可能参与Spred-2调控的PC12细胞分化。本研究发现Spred-2与Rabll相互作用,并且与自噬标志蛋白LC3存在共定位。研究结果如下：1、免疫荧光检测HeLa细胞内源Spred-2与内源Rab11定位,结果表明二者在胞浆中存在聚点状的共定位；将Myc-Spred-2与HA-Rab11共转至293T细胞经Anti-Myc抗体免疫共沉淀,免疫印迹结果表明Spred-2与Rab1 1存在相互作用。2、将Myc-Spred-2野生型及其各个结构域缺失突变体,分别与HA-Rab11共转至293T细胞,以Anti-Myc抗体免疫共沉淀,免疫印迹结果表明Spred-2蛋白通过C端的KBD与SPR结构域与Rabll相互作用。3、将Myc-Spred-2、DsRed-Rab11及绿色荧光蛋白标记的LC3(GFP-LC3)共同转染至HeLa细胞,免疫荧光结果表明Spred-2、Rab11及LC3三者在胞浆存在共定位。4、分别将Myc标签空载体,Myc-Spred-2野生型及SPR结构域缺失突变体与DsRed-Rab11和GFP-LC3,共转至HeLa细胞,免疫荧光结果表明Spred-2蛋白SPR结构域为Rab1 1与LC3共定位所必需。5、共转DsRed-Rabll与GFP-LC3至HeLa细胞,再分别使用雷帕霉素(Rapa)与氯喹(CQ)处理,免疫荧光结果表明Rapa促进Rab11与LC3共定位,而CQ抑制二者共定位。6、分别将Spred-2野生型及其突变体重组腺病毒感染PC12细胞,神经突触生长分析结果表明SPR结构域及其与LC3结合位点为Spred-2抑制PC12细胞分化所必需。综上所述,Spred-2抑制PC12细胞分化可能通过C端区域与Rab11相互作用,抑制Rab11l参与细胞分化的功能。Spred-2缺失SPR结构域,Rab11释放,并促进神经突生长。另外,Spred-2参与自噬,在自噬溶酶体形成后与Rab11及LC3形成蛋白复合体,从而抑制PC12细胞分化。
【关键词】：Spred-2 Rab11 PC12
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R736.6
【目录】：

• 中文摘要2-4
• 英文摘要4-9
• 符号说明9-12
• 第一章 Spred蛋白家族研究进展12-30
• 1. Spred家族的表达及定位12-14
• 2. Spred蛋白各个结构域及其功能14-16
• 2.1 EVH-1结构域14-15
• 2.2 KBD结构域15
• 2.3 SPR结构域15-16
• 3. Spred生物学功能16-19
• 3.1 Spred对于Ras/Raf/MAPK信号通路的抑制功能16-17
• 3.2 Spred-2与细胞分化17-18
• 3.3 Spred-2其他生物学功能18-19
• 4. Rab11蛋白研究进展19-21
• 参考文献21-30
• 第二章 Spred-2与Rab11相互作用影响大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤细胞PC12分化30-52
• 前言30
• 1 材料与方法30-41
• 1.1 材料30-33
• 1.1.1 细菌、质粒及细胞30-31
• 1.1.2 主要试剂和配方31
• 1.1.3 溶液配制31-32
• 1.1.4 主要实验仪器32-33
• 1.1.5 抗体和抑制剂33
• 1.2 实验方法33-41
• 1.2.1 目的基因亚克隆及突变体质粒构建33-36
• 1.2.1.1 pcDNA3.1-Myc-His-Spred-2-WT的构建33-34
• 1.2.1.2 pcDNA3.1-Myc-His-Spred-2-ΔEVH-1的构建34-35
• 1.2.1.3 pcDNA3.1-Myc-His-Spred-2-ΔKBD的构建35
• 1.2.1.4 pcDNA3.1-Myc-His-Spred-2-ΔSPR的构建35
• 1.2.1.5 pcDNA3.1-Myc-His-Spred-2-W370A-L373A-Y386A-L389A的构建35
• 1.2.1.6 Spred-2腺病毒质粒构建及鉴定35-36
• 1.2.2 细胞复苏、传代、冻存及计数36
• 1.2.3 Western Blot检测蛋白表达36-39
• 1.2.3.1 制备蛋白质样品36-37
• 1.2.3.2 制备免疫共沉淀样品37
• 1.2.3.3 SDS-PAGE电泳37-38
• 1.2.3.4 上样38
• 1.2.3.5 电泳38
• 1.2.3.6 电转移38
• 1.2.3.7 抗原抗体反应38-39
• 1.2.4 转染39
• 1.2.5 免疫荧光39-40
• 1.2.5.1 细胞爬片39
• 1.2.5.2 固定39
• 1.2.5.3 透化39
• 1.2.5.4 抗原抗体反应39-40
• 1.2.5.5 封片40
• 1.2.6 分析PC12细胞分化40-41
• 2 实验结果41-47
• 2.1 内源Spred-2与内源Rab11共定位41
• 2.2 外源Spred-2与外源Rab11结合41-42
• 2.3 Spred-2 C端与Rab11结合42-43
• 2.4 外源Spred-2、Rab11及LC3三者共定位43-44
• 2.5 Spred-2影响Rab11与LC3共定位44-45
• 2.6 自噬诱导剂与抑制剂影响Rab11与LC3共定位45-46
• 2.7 Spred-2与Rab11及LC3相互作用为抑制PC12细胞分化所必需46-47
• 3 讨论47-49
• 参考文献49-52
• 致谢52-53
• 攻读学位期间发表的学术论文53-54

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