MiR-374在间质干细胞突变肿瘤细胞系形成及迁移中的作用及机制研究

发布时间：2017-11-03 16:01

  本文关键词：MiR-374在间质干细胞突变肿瘤细胞系形成及迁移中的作用及机制研究

  更多相关文章： rBM-MSC K3细胞株 miR-374 wnt5a 钙离子信号通路

【摘要】：目的前期的研究工作已构建r BM-MSC(rat bone marrow mesenchymal stem cell)体内突变致瘤模型,并成功分离培养获得肿瘤细胞株K3,本研究旨在探讨r BM-MSC体内恶性转化机制。mi RNAs与肿瘤的发生、进展密切相关,因此寻找调控r BM-MSC突变的关键mi RNAs,并根据其作用靶点确定参与细胞突变的关键信号转导通路。方法micro RNA芯片筛选rBM-MSC与K3间差异表达的miRNAs分子,基于文献报道与肿瘤发生的相关性和差异明显两个原则选取mi RNAs通过q RT-PCR验证。对于确实上调/下调的mi RNAs,分别将相应的模拟物及抑制物转染入r BM-MSC,q RT-PCR验证转染效率后,生长曲线、克隆形成、细胞周期等实验方法检测细胞的增殖能力有无变化,transwell迁移实验检测细胞转染后迁移能力的改变,免疫荧光检测迁移相关指标E-cadherin,N-cadherin的变化。相反的,将对应的抑制物及模拟物转染入K3观察其增殖与迁移能力是否与r BM-MSC变化相反。对于影响细胞增殖及迁移的mi RNAs,利用靶基因预测数据库预测其下游靶基因,q RT-PCR及荧光素酶报告基因验证其直接靶向作用。Western-blot检测mi RNA调控靶基因的下游蛋白的变化及相关信号通路。结果经筛选和验证r BM-MSC中mi R-374的表达明显高于K3,而mi R-199a、mi R-145、mi R-34a、mi R-214、mi R-350的表达明显低于K3。r BM-MSC转染mi R-374模拟物后,r BM-MSC平板克隆能力增强,细胞周期S期延长,这些均表明mi R-374高表达可促进r BM-MSC增殖,transwell迁移实验证实过表达mi R-374的r BM-MSC迁移细胞数增多,另外免疫荧光发现其上皮标志E-cadherin减弱,间质标志N-cadherin增强,这一结果也提示转染后的r BM-MSC迁移能力增强。而在K3转染mi R-374抑制物后,生长曲线、平板克隆形成实验均显示K3增殖水平减低,transwell迁移实验、E-cadherin、N-cadherin结果表明迁移能力降低。经mi RGen、Target Scan及Pic Tar数据库预测结合与肿瘤相关性,从mi R-374预测的靶基因中筛选获得wnt5a,双荧光素酶报告基因分析、q RT-PCR和western-blot验证了wnt5a是mi R-374的直接靶基因。此外,western-blot显示wnt5a下游蛋白钙/钙调素依赖性蛋白激酶II(Ca MKⅡ)和蛋白激酶C(PKC)表达在mi R-374升高时均明显降低。结论r BM-MSC突变成肿瘤细胞K3后,mi R-374明显升高,mi RNA缺失及过表达实验证明mi R-374影响r BM-MSC的增殖及迁移,且两者对K3增殖与迁移的作用与r BM-MSC相反,功能学实验表明mi R-374在r BM-MSC恶性突变中具重要意义。Wnt5a作为mi R-374的靶基因,可通过活化钙离子信号通路促进肿瘤的增殖与迁移,而通路中的两个关键信号分子Ca MKⅡ和PKC均于mi R-374升高时表达下降,提示mi R-374通过wnt5a调节钙离子信号通路参与体内r BM-MSC突变成瘤。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.2

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