PADI4在ATRA诱导HL-60细胞分化过程中的作用及其信号通路调控研究

发布时间：2017-11-04 15:06

  本文关键词：PADI4在ATRA诱导HL-60细胞分化过程中的作用及其信号通路调控研究

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【摘要】：背景白血病是一类造血干细胞的恶性克隆性疾病,因白血病细胞自我更新增强、增殖失控、分化障碍、凋亡受阻而停滞在细胞发育的不同阶段,是导致人类死亡的恶性肿瘤之一。流行病学调查显示,白血病每年发病率约为3-4/105,约占恶性肿瘤总发病率的5%,我国每年新增白血病患者40 000多例,其中20 000多例患者是儿童。骨髓移植(Bonemarrow transplantation,BMT)是急性白血病最有效治疗方法,但受费用昂贵,风险大,HLA相同的供体不足等条件限制,且移植后合并症较多,早期死亡率高,在国内推广使用尚有困难。目前,白血病属于血液系统的恶性克隆性疾病,大部分仍无法彻底治愈,联合化疗仍是急性白血病的主要治疗手段。近年来的研究发现,全反式维甲酸(All-Trans-Retinoic Acid,ATRA)又名维A酸,其他名如维甲酸、维A甲酸等,化学名称为(13E)分子式为C20H2802,主要是维生素A酸的衍生物,为维生素A在体内的中间代谢产物,是维持生长发育不可缺少的物质,可以诱导VSMC分化及抑制VSMC增殖。维甲酸受体(retinoic acid receptor,RAR)是一种重要的细胞核受体,有α、β、γ三种亚型,在VSMC中存在的RARα与ATRA结合后诱导VSMC分化。Krüppel样因子4(krüppel-like factor,KLF4)是含有锌指结构的核转录因子,在VSMC增殖、分化、迁移及凋亡等过程中发挥重要作用。因此ATRA具有很强的诱导细胞分化及免疫调节作用,是目前国内治疗急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocyticleukemia,APL)、骨髓异常增生等血液恶性疾病的临床首选药.肽酰基精氨酸脱亚胺酶--PADI4(Peptidylarginine deiminase 4),包含2238个碱基对,编码663个氨基酸,分子量为67KDa,广泛分布于动物组织中,其编码的酶可以催化精氨酸残基转化为瓜氨酸残基,此过程称为瓜氨酸化。该过程需要Ca2+的协助,转化为瓜氨酸残基的蛋白构象也发生改变,从而导致酶的活性变化。已有研究表明在不同的实体瘤中PADI4高表达,在HL-60等不同类型的白血病细胞株中PADI4的表达情况有所不同PADI4在造血细胞中很少表达,但是在经ATRA诱导HL-60细胞向粒细胞以及巨噬细胞分化过程中可以检测到PADI4的表达,因此考虑PADI4和白血病细胞的分化与凋亡有关。但是在生理状态下,PADI4在白血病的分化过程中的功能及其作用的机制还不是很明确。有报道表明全反式维甲酸可以明显的诱导白血病细胞HL-60向粒系分化。部分学者发现在白血病的治疗过程中,MAPK,PI3K/Akt和NF-κB等信号通路参与基因表达调控、细胞增殖和凋亡的过程。其中ERK1/2是MAPK家族成员,分子量分别为44k Da和42k Da,磷酸化的P44/42有介导细胞因子转录活化的作用,并参与细胞增殖与分化。PI3K/Akt通路广泛存在细胞中,是参与细胞生长、增殖、分化调节的信号转导通因此,本研究拟以ATRA诱导HL-60细胞为分化模型,初步探讨PADI4在白血病细胞分化过程中的变化规律,并进一步深入探讨PADI4参与ATRA诱导HL-60细胞分化过程中MAPK,PI3K/Akt和NF-κB等信号通路是否发挥作用,揭示PADI4影响白血病细胞分化的分子机制。这为白血病的新治疗方案提供了重要的理论依据,对治疗白血病有着重大的意义。目的本课题在以上研究背景的基础上,探讨在全反式维甲酸诱导早幼粒白血病细胞HL-60细胞向粒系分化过程中PADI4的表达变化与功能机制。通过体外实验探讨PADI4基因与白血病细胞HL-60细胞分化是否有关为切入点,重点观察HL60细胞经全反式维甲酸诱导向粒系分化后PADI4表达变化,以及调控PADI4表达后对MAPK,PI3K/Akt和NF-κB等信号通路影响,拟验证PADI4基因与白血病的关系,为白血病的临床治疗提供一个新的治疗靶点。方法ATRA诱导HL-60细胞24 h、48 h、72 h、96 h后,应用Wright-Gimesa染色观察细胞形态学的变化;运用流式细胞术检测细胞表面分化抗原CD11b的表达变化;应用RT-PCR分析PADI4在基因水平的表达趋势,Western blot的方法检测PADI4在蛋白水平的表达变化;RNAi技术干扰PADI4及PADI4抑制剂后流式细胞仪检测CD11b变化,Western blot检测PADI4、P42/44、P65、P105、P55等蛋白水平变化。统计学分析试用spss17.0软件。结果HL-60细胞经ATRA诱导后与对照组相比,Wright-Gimesa染色显示细胞核明显缩小,核仁消失.胞浆变多,核浆比明显减小,核有凹陷及分叶,杆状核、分叶核现象明显增多;细胞表面分子CD11b表达由2.1%升高到48.9%(P0.05);随着ATRA诱导时间的延长PADI4在基因和蛋白水平都有增高趋势;干扰PADI4表达后,或者使用PADI4抑制剂后再用ATRA诱导72h,PADI4蛋白表达量降低,HL-60细胞CD11b表达降低,磷酸化的P42/44蛋白水平降低,P65、P105、P55等蛋白水平变化均不明显。结论ATRA诱导HL-60细胞定向粒系分化的过程中,PADI4促进HL-60细胞向粒系分化,而且PADI4可能是通过促进MAPK信号通路中的p42/44磷酸化而发挥作用。
【学位授予单位】：济南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R733.7

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本文编号：1139910