人脐带间充质干细胞对骨肉瘤细胞的调控作用及机制的体外研究

发布时间：2017-11-07 01:35

  本文关键词：人脐带间充质干细胞对骨肉瘤细胞的调控作用及机制的体外研究

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【摘要】：目的:探讨体外人脐带间充质干细胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)对骨肉瘤细胞(Saos-2)增殖和迁移的作用及其分子机制。方法:采用组织块贴壁法分离培养hUC-MSCs,流式细胞术检测hUC-MSCs表面标志物CD19、CD29、CD90和CD105,茜素红和油红O染色分别鉴定细胞的成骨、成脂分化潜能。收集并配制不同浓度hUC-MSCs条件培养基(hUC-MSCs conditioned medium,hUC-MSCs-CM),细胞计数法和细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)检测hUC-MSCs-CM及重组人白介素6(recombinant human interleukin 6,rh IL-6)对Saos-2细胞增殖的影响。酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测hUC-MSCs和Saos-2细胞分泌的IL-6的量。Western-blot检测IL-6、hUC-MSCs-CM及AG490对Saos-2细胞STAT3、p-STAT3蛋白的表达的影响,RT-PCR检测PCNA、Cyclin D1、Survivin、STAT3基因的转录水平,细胞计数法和CCK-8检测各组Saos-2细胞增殖能力的变化。划痕实验和Transwell迁移实验检测各组Saos-2细胞迁移能力的变化及hUC-MSCs对Saos-2细胞的迁移能力。结果:成功分离培养出成纤维样贴壁细胞,细胞强阳性表达(97%)CD29、CD90、CD105,阴性表达(0.1%)CD19,具有成骨、成脂分化的能力。细胞计数和CCK-8检测显示hUC-MSCs和rh IL-6均能明显促进Saos-2细胞增殖,且不同浓度对Saos-2细胞的促增殖效果差异明显(P0.05),呈现浓度依赖性。ELISA检测发现hUC-MSCs-CM中IL-6浓度可达1804.8±152.2 ng/L(5×105 hUC-MSCs/m L*24 h),而同样数量的Saos-2细胞分泌的IL-6浓度仅为170.1±22.5 ng/L。Western blot显示AG490可明显抑制Saos-2细胞STAT3的活化水平,hUC-MSCs-CM和rh IL-6均能激活STAT3,IL-6中和抗体则明显削弱了hUC-MSCs-CM的激活作用。各组Saos-2细胞STAT3的转录和蛋白表达水平均无明显差异(P0.05)。hUC-MSCs-CM和rh IL-6均能上调Saos-2细胞增殖相关基因PCNA、Cyclin D1、Survivin的表达,用IL-6中和抗体或AG490抑制STAT3的活性后,各增殖相关基因的m RNA转录水平明显下调,细胞计数和CCK-8显示各组Saos-2增殖能力的变化与基因表达水平一致。划痕实验和Transwell迁移实验显示,hUC-MSCs具有向Saos-2细胞靶向迁移的能力;rh IL-6和hUC-MSC-CM均增强Saos-2细胞的迁移能力,于CM中加入IL-6中和抗体,细胞迁移能力明显减弱,并低于对照组;CM+AG490组穿过聚碳酸酯膜的细胞数量明显少于Control组及CM组。结论:(1)hUC-MSCs能向骨肉瘤细胞定向迁移并分泌大量的IL-6;(2)hUC-MSCs分泌的IL-6能通过激活骨肉瘤细胞的STAT3信号通路,上调PCNA、Cyclin D1、Surviving的表达促进骨肉瘤细胞增殖;(3)hUC-MSCs分泌的IL-6能通过激活骨肉瘤细胞的STAT3信号通路促进骨肉瘤细胞迁移。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R738.1

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本文编号：1150288