miR-365过表达通过靶向ADAMTS-1刺激乳腺癌细胞的增殖与侵袭

发布时间：2017-11-08 22:04

  本文关键词：miR-365过表达通过靶向ADAMTS-1刺激乳腺癌细胞的增殖与侵袭

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【摘要】：背景与目的乳腺癌(Breast cancer)是全世界女性癌症相关死亡的一个主要原因。随着医学的深入研究,人们逐渐认识到可以通过改变乳腺癌细胞的生物学特性而达到治疗肿瘤的目的,分子靶向治疗由此诞生。目前的研究表明,乳腺癌的发生发展涉及一系列基因水平上的改变。Micro RNAs(mi RNAs)是一类保守的小分子内源性非编码RNAs,在多种生理病理学过程中起重要作用,包括细胞增殖、分化、细胞凋亡以及表观遗传学改变等等。mi RNAs能靶向靶基因的3′-UTR区,通过抑制基因翻译或者引起靶基因降解来调控基因表达。研究发现mi RNAs在乳腺癌的起始和发展中起重要作用。自从2005年首次报道了mi RNAs在乳腺癌中的差异表达,随后的一系列研究表明mi RNAs的异常表达与乳腺癌密切相关。因此基于mi RNAs的调控,进一步研究新的肿瘤治疗方法尤为重要。本研究旨在分析mi R-365及ADAMTS-1 m RNA在乳腺癌组织及癌旁组织中的差异表达及其与乳腺癌临床病理特征之间的关系,在体外实验中研究mi R-365对MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌细胞增殖、细胞周期和细胞侵袭能力的影响,并初步探索mi R-365与ADAMTS-1之间的靶向关系。方法1、收集64例乳腺癌患者手术切除标本,采用q RT-PCR方法检测mi R-365及ADAMTS-1 m RNA在乳腺癌组织及癌旁组织中的表达情况,并分析其表达与乳腺癌临床病理特征之间的关系。2、采用脂质体转染MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌细胞,实验分为mi R-365mimics转染组(mi R-365 mimics组)、mi R-365 inhibitor转染组(mi R-365 inhibitor组)、mi R-365 negative control转染组(NC组)和空白对照组(Blank组),转染后细胞置于细胞培养箱继续培养。3、利用CCK-8细胞生长实验,观察mi R-365对MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌细胞增殖能力的影响。4、利用细胞周期实验观察mi R-365对MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌细胞周期的影响。5、利用Transwell侵袭实验观察mi R-365对MDA-MB-231乳腺癌细胞侵袭能力的影响。6、Target Scan、Pic Tar和mi Randa软件预测mi R-365的靶基因,构建pmir GLO与野生型和突变型ADAMTS-1 3′-UTR区的重组载体,通过双荧光素酶报告实验和Western blotting实验验证ADAMTS-1是否是mi R-365的直接靶点。7、构建无3′-UTR区ADAMTS-1表达载体pc DNA3.1-ADAMTS-1,通过restore实验分析mi R-365调控ADAMTS-1表达的作用机制。结果1.采用q RT-PCR方法检测mi R-365及ADAMTS-1 m RNA在乳腺癌组织及癌旁组织中的表达情况。结果显示相比于癌旁组织(癌旁组织的相对表达水平为1),乳腺癌组织中mi R-365的相对表达水平(2.711±0.893)显著升高(P0.05),而ADAMTS-1 m RNA的表达均值(0.528±0.371)明显降低(P0.05),并且mi R-365和ADAMTS-1 m RNA的表达水平与乳腺癌患者的TNM分期有关(P0.05),而与患者的年龄、肿块大小、淋巴结转移情况以及雌激素和孕激素受体情况无关(P0.05)。2.MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌细胞转染mi R-365 mimics后其mi R-365表达水平(MCF-7:6.274±0.591;MDA-MB-231:7.841±0.643)显著升高,而转染mi R-365 inhibitor后其mi R-365表达水平(MCF-7:0.216±0.148;MDA-MB-231:0.126±0.104)显著降低,并且差异具有统计学意义(P0.05)。3.CCK-8细胞生长实验结果显示,在乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7中,相比于NC组和Blank组,mi R-365 mimics组细胞的OD450值在2day、3day、4day这三个时间点均有所升高,而mi R-365 inhibitor组细胞的OD450值在2day、3day、4day这三个时间点均有所降低,尤其是在4day时具有显著差异(P0.05)。4.细胞周期实验结果显示,在mi R-365 inhibitor转染组中处于G0/G1期的细胞数显著高于NC组和Blank组,同时处于S期的细胞数显著低于NC组和Blank组(P0.05)。5.Transwell侵袭实验结果显示,在MDA-MB-231细胞中转染mi R-365inhibitor后穿过基底膜的细胞数明显下降,差异具有统计学意义(P0.05)。6.双荧光素酶报告实验结果显示在MDA-MB-231细胞中,mi R-365 mimics与野生型ADAMTS-1重组载体共转染组细胞的荧光素酶活性明显降低(P0.05),而mi R-365 inhibitor与野生型ADAMTS-1重组载体共转染组细胞的荧光素酶活性明显升高(P0.05),而其他各组共转染之后对荧光素酶活性没有明显影响。7.Restore实验结果显示在乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞中,与仅转染NC的细胞相比,mi R-365 mimics转染组细胞中的ADAMTS-1蛋白的表达量明显降低,处于G0/G1期的细胞数明显减少,侵袭细胞数明显增加(P0.05);而共转染mi R-365 mimics和表达载体pc DNA3.1-ADAMTS-1组和转染表达载体pc DNA3.1-ADAMTS-1组的细胞中ADAMTS-1蛋白表达量均明显升高,处于G0/G1期的细胞数明显增加,并且侵袭细胞数明显减少(P0.05)。结论1.乳腺癌组织中的mi R-365异常高表达,ADAMTS-1 m RNA相对明显低表达,并与乳腺癌患者的TNM分期有关。2.下调mi R-365的表达水平能抑制MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌细胞的增殖能力,并能抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞的侵袭能力。3.mi R-365可能作为癌基因通过靶向ADAMTS-1的3′-UTR区来发挥生物学功能。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.9

【参考文献】

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1 马涛;张君莹;吴建中;唐金海;;miR-342-3p对三阴性乳腺癌化疗敏感性的影响[J];中南大学学报(医学版);2014年05期

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本文编号：1159012