受体酪氨酸激酶EphA1和PTK7在卵巢浆液性肿瘤中的表达研究

发布时间：2017-11-10 01:03

  本文关键词：受体酪氨酸激酶EphA1和PTK7在卵巢浆液性肿瘤中的表达研究

  更多相关文章： EphA1 卵巢浆液性肿瘤 PTK7 组织分级 预后

【摘要】：卵巢癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一,约占女性生殖道恶性肿瘤的1/4,且死亡率高,居妇科肿瘤中的首位。卵巢浆液性癌是卵巢癌中最常见的病理组织学类型,占所有浆液性肿瘤中的35%。卵巢其它的浆液性肿瘤还包括良性浆液性囊腺瘤和交界性卵巢浆液性肿瘤。卵巢癌缺乏明显的早期临床症状及可靠的生物学标志,早期诊断困难,约2/3以上的患者在确诊时,已是临床晚期。尽管随着外科手术操作的完善和新辅助化疗方案的优化,卵巢癌患者5年生存率有所提高,但仍然不足30%。探索与卵巢浆液性癌生物学行为相关的分子机制,为卵巢浆液性癌的早期诊断、进展评估、预后判断及个体化治疗的研究提供重要线索。受体酪氨酸激酶是一类跨膜受体,在细胞信号转导中具有重要作用,不仅参与细胞的增殖、分化、迁移及生长发育,同时也与肿瘤的发生和发展密切相关。促红细胞生成素产生肝细胞激酶(Erythropoietin-producing Hepatocyte,Eph)是受体酪氨酸激酶家族中的最大亚族。EphA1是1987年发现的Eph家族成员,是典型的受体酪氨酸激酶。PTK7是新近发现的受体酪氨酸激酶成员。EphAl和PTK7均由胞外域、跨膜区和胞内域构成,二者在结构上的差别主要有两点：1、EphAl胞外域含有与配体结合的球形结构域,EphrinAl或EphrinA3是它的两个高亲和力配体。PTK7胞外域由7个免疫球样蛋白环构成,尚未发现有特异性配体的存在。2、EphAl胞内域的受体酪氨酸激酶域具有催化活性,而PTK7胞内域的受体酪氨酸激酶域无催化活性。受体酪氨酸激酶EphA1和PTK7参与细胞增殖、分化、粘附、凋亡等过程,在生长发育及肿瘤发生发展中具有重要作用。EphA1在肺腺癌、肝癌、乳腺癌和食管鳞状细胞癌中高表达,而在非黑色素瘤皮肤癌和结肠癌标本中低表达。PTK7在结肠癌、肺癌和胃癌中高表达,而在肾透明细胞癌中低表达。关于EphA1和PTK7在卵巢癌中的表达研究目前仅检索到3篇文献。Herath和Wong等人分别用RT-PCR方法和DASL技术发现EphAl mRNA在卵巢癌组织标本中高表达,Pejovic等人利用RNA探针检测卵巢癌表面激酶发现PTK7 RNA的表达从正常卵巢上皮、卵巢癌高危人群的卵巢上皮再到卵巢上皮性癌呈线性下调趋势。此三篇文献对于EphA1和PTK7基因在卵巢癌中表达的研究均基于RNA水平上,所采用的卵巢癌组织标本数不足20例,同时包含卵巢癌其它的组织学类型如粘液性癌等。有关EphAl和PTK7在卵巢癌特定的组织学类型即浆液性肿瘤中的表达及临床病理意义的研究,至今尚未检索到相关报道。目的本研究采用免疫组织化学方法检测EphA1和PTK7蛋白在14例正常输卵管上皮、6例浆液性囊腺瘤、51例交界性浆液性卵巢肿瘤和97例卵巢浆液性癌组织中的表达水平。分析二者在卵巢浆液性癌中的表达情况与临床病理特征及预后的关系,为卵巢浆液性癌的早期诊断、进展评估及预后判断提供证据。并采用转染方法研究EphA1过表达对卵巢浆液性癌细胞株生物学行为的影响。材料本研究所用的石蜡组织标本来自南京军区南京总医院和南京市妇幼保健院2001年～2013年存档病例。其中因妇科良性疾病手术的正常输卵管组织14例,卵巢良性浆液性囊腺瘤组织6例,交界性浆液性卵巢肿瘤51例,浆液性卵巢癌97例。其中在交界性浆液性卵巢肿瘤中临床早期(Ⅰ期)32例,临床(Ⅱ+Ⅲ)期19例,有转移19例,无转移32例,双侧15例,单侧36例。浆液性卵巢癌97例,其中83例浆液性卵巢癌有完整病理资料,余有部分病理资料。临床早期(Ⅰ+Ⅱ)病例33例,临床晚期(Ⅲ+Ⅳ)病例64例,WHO分级(1+2级)28例,3级55例,MDACC分级低级别13例,高级别70例,有淋巴结/腹膜43例,无转移40例。患者术前均未接受放化疗,取标本均经患者同意签署知情同意书,并获得医院伦理委员会批准。所用的2株人浆液性卵巢癌细胞系H08910和A2780均购自于上海细胞库。方法1细胞培养细胞在含10%胎牛血清的DMEM完全培养基中,37℃、5%CO2和95%空气饱和湿度的培养箱中常规培养。2细胞免疫化学将消化后的H08910和A2780细胞悬浮液置于事先放有干净盖玻片的培养皿中常规培养,当细胞达70%融合度时,捞片,冷丙酮固定15～20min。用3%H2O2水封闭10min,分别滴加EphA1和PTK7一抗(1：100),4℃冰箱过夜,滴加二抗室温孵育30min, DAB显色2min,自来水终止显色。苏木素复染,封片。3细胞转染细胞转染采用阳离子脂质体法,待A2780和H08910细胞达到40%-50%融合度时,按Invitrogen公司Lipofectamine 2000 Transfection Reagent转染试剂说明书进行转染。不加转染试剂和质粒的空白对照组记作未转染组(UTG),加转染试剂和空载质粒的记作模拟组(MG),加转染试剂和EphAl质粒的实验组记作转染组(TG)。用100μl DMEM无血清培养基分别稀释2μl转染试剂及2μg空载质粒或EphA1质粒,质粒和转染试剂分别混匀室温静置5min后,二者混合混匀室温再静置15min。去掉培养板的培养基,PBS清洗2遍后,换为1800μl无血清DMEM培养基,并将混合物加入相应的组内,其中UTG组再补200μl无血清DMEM培养基,摇匀。在常规培养条件下培养4h后,换为含血清的培养基继续培养。转染48h进行荧光显微镜观察和后续实验。4 RT-PCR收集转染48h后的细胞,采取Trizol法提取总RNA,选择O1igdT引物,按Takara逆转录试剂盒说明书操作步骤,半定量反转录合成CDNA。以上述反转录产物cDNA为模板扩增EphA1和β-actin内参。β-actin作为内参,根据基因库mRNA序列(GenBank序列号：NM_001101.3)设计其上游和下游引物分别为：5'-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3'和5'-CCTAGAAGCATTTGCGGTGG-3’,PCR产物长度为416bp。根据基因库mRNA序列(GenBank序列号：NM_005232)设计EphA1上游引物和下游引物分别为：5'-ATCTTTGGGCTGCTGCTTGG-3'和 5'-GCTTGTCCTCTCGATCCACATC-3’,PCR产物长度为12Tbp。反应条件为94℃3min,30×(98℃10s,55℃10s,72℃60s),72℃ 10min。 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统摄片。5细胞增殖检测MTT法转染48h时,将六孔板中的各组细胞消化后以100μl约1×104个细胞含量的密度种于5个复孔中(100μl/孔),24h时按凯基MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(KGA311)说明书进行,加50μl×MTT于各孔中,培养4h后弃去板中的培养液。加150μl DMSO于各孔中,振荡使结晶物充分融解。使用酶标仪于490nnm波长处检测并记录每个孔的OD值。6划痕实验质粒转染细胞传代培养24h时,细胞融合度达到60%以上时用20μl移液枪枪头在六孔板均匀划“一”字线。用PBS漂洗2遍后更换未含血清的DMEM培养基培养24h后,观察并拍照。采用ImageJ软件,在图片上随机划6条直线,测量出细胞间相对距离,评价迁移情况。7免疫组织化学(Envision法)石蜡切片经60℃2h烤片后,脱蜡水化。采用柠檬酸盐法进行抗原修复,3%H202去离子水封闭内源性过氧化物酶,分别加入EphA1 (1:100)和PTK7 (1:100)置于4℃湿盒中孵育过夜或p53(1：200)一抗,37℃1h。加入二抗,室温放置30min后,DAB显色,自来水终止显色,苏木精复染,脱水,透明,封片。综合细胞染色程度和阳性细胞百分比进行评分。染色程度标准：基本不着色为0分；淡黄色为1分；黄色为2分；棕黄色为3分。阳性比例评分标准：阳性细胞数0%为0分；≤10%为1分；10%～50%为2分；50%-80%为3分：80%为4分。根据染色程度和阳性比例评分乘积,4分者为阳性高表达,约≤4分者为阴性低表达。8统计分析采用SPSS 16.0统计分析软件进行分析。所有计量资料用(平均值±标准差)表示,两样本均数比较采用t检验。应用χ2检验或fisher确切概率法分析EphA1和PTK7蛋白的表达与临床病理特征之间的关系。 Kaplan-meier单因素生存分析其蛋白表达水平与患者生存时间的关系,筛选预后相关因素。采用COX比例风险回归法,分析影响浆液性卵巢癌患者整体生存率的独立预后因素。采用Sperman相关性分析探讨EphA1和PTK7与p53是否具有相关性。认为P0.05具有统计学意义。结果：EphA1对A2780和H08910细胞系生物学行为影响的研究：EphAl蛋白在A2780中的表达为弱阳性,在H08910中的表达为阴性,RT-PCR显示EphA1mRNA在A2780和H08910均阴性。EphAl质粒转染传代培养24h后,MTT法检测H08910和A22780各组细胞的增殖数量显示转染组、模拟组、未转染组OD值逐渐升高,差异均有统计学意义(P0.05)。24h划痕实验结果示H08910转染组细胞相对间距(1348.00±37.20)明显高于未转染组(101.83±21.40)和模拟组(707.00±54.71)(P0.001)。A2780转染组细胞相对间距(1177.00±15.13)明显高于未转染组(159.83±42.52)和模拟组(463.00±44.99)(P0.001)。EphA1在卵巢浆液性肿瘤组织标本中的表达及意义：EphAl蛋白在正常输卵管上皮组织和浆液性囊腺瘤中阳性表达率均为100%(14/14,6/6),在卵巢交界性浆液性肿瘤中阳性表达率为92.15%(47/51),EphAl蛋白在输卵管正常上皮、卵巢浆液性囊腺瘤和交界性卵巢浆液性肿瘤中的表达无显著差异(P0.05)。EphA1在卵巢浆液性癌中阳性表达率为43.30%(42/97)o EphAl在浆液性卵巢癌中低表达,与正常输卵管上皮、良性浆液性卵巢肿瘤、交界性浆液性卵巢肿瘤中表达相比均具有统计学意义(P0.001)。EphAl在卵巢交界性浆液性肿瘤中的表达与临床分期、转移情况(淋巴结和/或腹膜转移)、发生部位和年龄无关(P＞0.05)。 EphA1蛋白在浆液性卵巢癌组织中的表达与临床分期、WHO分级和二级组织学(MDACC)分级相关(P=0.004,P0.001,P=0.008),与转移情况、肿瘤部位、肿瘤最大径和年龄无关(P0.05)。PTK7蛋白在卵巢浆液性肿瘤中的表达及意义：PTK7蛋白在卵巢癌细胞株HO8910及A2780中呈阴性表达。PTK7蛋白在92.86%(13/14)正常输卵管上皮、83.33%(5/6)卵巢浆液性囊腺瘤、45.10%(23/51)交界性浆液性卵巢肿瘤和28.87%(28/97)浆液性卵巢癌中阳性表达。正常输卵管上皮与卵巢浆液性囊腺瘤、卵巢浆液性囊腺瘤与交界性浆液性肿瘤之间的PTK7表达无显著差异(P=0.521,P=0.102)。浆液性卵巢癌与正常输卵管上皮、卵巢浆液性囊腺瘤以及交界性浆液性肿瘤之间PTK7表达存在显著差异(P0.001,P=0.012,P=0.048)。PTK7在交界性浆液性卵巢肿瘤中的表达与临床分期和转移情况(淋巴结和/或腹膜转移)有关(P=0.038,P=0.038),与发生部位和年龄无关(P=0.088,P=0.896)。PTK7在卵巢浆液癌中的表达与临床分期(P=0.034)、WHO分级(P=0.004)、MDACC病理分级(P0.001)和转移情况(P=0.025)有关,与发生部位(P=0.326)、肿瘤直径(P=0.298)和年龄(P=0.584)无关。结合p53蛋白在卵巢浆液性癌中的表达,综合分析EphAl和PTK7蛋白在卵巢浆液性癌中的表达：Sperman相关性分析发现EphAl与p53不相关(P0.05),PTK7与p53呈弱的负相关(r=-0.219, P=0.045)。对卵巢浆液性癌患者预后采用单因素生存分析Log Rank检验发现,浆液性卵巢癌患者的预后与临床分期(P0.001)、MDACC分级(P=0.015)、WHO分级(P=0.003)、转移情况(P=0.006)、肿瘤部位(P=0.042)、EphA1(P=0.001)、PTK7(P=0.017)和p53(P=0.007)表达有关,而与肿瘤最大径(P=0.262)和年龄(P=0.639)无关。临床早期预后好于临床晚期,低级别好于高级别,WHO分级(1+2)级好于3级,无转移好于有转移的,单侧部位肿瘤肿瘤好于双侧部位的,PTK7及EphAl高表达组好于其低表达组,p53低表达组好于其高表达组。Cox分析发现临床分期是其预后的独立因素(P0.001),MDACC分级、WHO分级、转移情况、肿瘤部位、肿瘤最大径、年龄、EphA1、PTK7和p53均不是其独立的预后因素(P0.05)。结论：EphA1在输卵管正常上皮、良性及交界性浆液性卵巢肿瘤表达无差别,均比浆液性癌中的表达高。PTK7蛋白在输卵管正常上皮、良性、交界性、恶性浆液性卵巢肿瘤中的表达呈逐步下调趋势。EphAl和PTK7蛋白的低表达均与浆液性卵巢癌较晚临床分期、高组织分级、预后差正相关,提示二者参与卵巢浆液性癌的发生发展,可能成为卵巢浆液性肿瘤辅助诊断及临床预后的新指标。EphA1对卵巢癌细胞系H08910和A2780的增殖及迁移具有抑制作用。PTK7与p53负相关,提示PTK7可能通过p53的相关通路,在卵巢浆液性癌中发挥抑癌基因的功能。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.31

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 赵立武;申彦;师宜荃;刘艳;刘易欣;;P16、P53和CyclinD1蛋白在卵巢浆液性肿瘤中的表达及意义[J];解剖学研究;2012年04期

2 王建东;董迎春;李国立;马恒辉;王绪林;盛蓁;周晓军;;胃癌组织中EphA1的表达与肿瘤转移及患者生存时间的关系[J];中国癌症杂志;2010年11期

，

本文编号：1164352