亚硝酸盐和铵盐联合暴露促进肝癌细胞增殖和侵袭

发布时间：2017-11-11 22:34

  本文关键词：亚硝酸盐和铵盐联合暴露促进肝癌细胞增殖和侵袭

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【摘要】：背景:随着农业化肥及工业防腐剂的广泛应用,自然界水体和土壤中氨氮及亚硝态氮的含量逐年增加。流行病学调查显示,氨氮及亚硝态氮污染严重的地区,癌的发生率和死亡率逐年增高,提示亚硝酸盐可能有致癌作用。近年来,亚硝酸盐的致癌作用受到了质疑,动物实验研究没有直接的证据证明亚硝酸盐就是致癌物质,另外却发现了其一系列药用价值,比如降低高血压和高血脂,保护器官缺血再灌注损伤等。许多学者因此建议将亚硝酸盐开发为临床药物。关于这个问题,课题组认为还需要慎重。因为亚硝酸盐的这些药用价值是通过其在酸性缺氧环境中还原成一氧化氮而实现的。肿瘤细胞生活的微环境呈现缺氧酸性特征,另外肿瘤微环境是一个高氨环境,在这样的微环境中,亚硝酸盐也会还原成一氧化氮,对肿瘤细胞有促进作用。迄今为止,还没有发现亚硝酸盐在高氨环境中对肿瘤细胞生物作用的文献。而揭示亚硝酸盐和铵盐共同存在的前提下,肿瘤细胞增殖和侵袭能力会发生什么变化,对全面了解亚硝酸盐的生物学作用有着非常重要的意义。目的:探讨亚硝酸盐和铵盐联合暴露对人肝癌细胞增殖和侵袭能力的影响。方法:实验分为四组,分别为空白对照组、亚硝酸钠组、氯化铵组、亚硝酸钠和氯化铵混合组。采用MTT实验检测细胞活力,筛选出最适处理浓度及最佳处理时间;微管荧光示踪剂观察细胞有丝分裂相初步分析细胞增殖情况;划痕实验检测细胞迁移能力;线粒体示踪剂和微丝示踪剂荧光显微镜下观察细胞线粒体和微丝变化,检测细胞运动能力;比色法检测细胞ATP含量;Transwell小室实验检测细胞侵袭能力;活性氧(ROS)检测试剂盒检测细胞内ROS水平;ELISA试剂盒检测鸟氨酸脱羧酶(ODC)的活性;Western Blot检测基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、鸟氨酸脱羧酶(ODC)的表达。结果:1.亚硝酸钠和氯化铵联合暴露促进肝癌细胞增殖活性的最适浓度和时间确定MTT结果显示:亚硝酸钠、氯化铵、亚硝酸钠和氯化铵混合物(V:V=1:1)对肝癌SMMC-7721细胞的促增殖活性的最佳浓度皆为150μM,各处理组促增殖活性的适宜时间为24 h,混合组与其它各组相比促增殖活性更加明显。2.微管示踪剂观察细胞有丝分裂相结果显示:亚硝酸钠组、氯化铵组与对照组相比细胞有丝分裂相略有增加,而混合组与对照组、亚硝酸钠组、氯化铵组相比有丝分裂相明显增多,混合物组比单独应用亚硝酸钠有更强的促进肝癌细胞增殖的能力。3.亚硝酸钠和氯化铵联合暴露增强肝癌细胞迁徙和侵袭能力划痕实验结果显示:与对照组、亚硝酸钠组、氯化铵组相比,混合组的相对划痕愈合距离更大,水平运动能力更强;荧光显微镜下可见混合组细胞微丝形成大量应力纤维,有大量板状伪足和丝状伪足的形成,线粒体数量较其他各组增多;混合组细胞ATP含量增加明显。Trans well细胞侵袭实验结果显示:混合组穿过基底膜的细胞数与对照组、亚硝酸钠组、氯化铵组相比明显增多,侵袭能力增强。Western blotting结果显示:与对照组、亚硝酸钠组、氯化铵组相比,混合物组MMP-2和MMP-9的表达量都明显升高,以上各结果显示:混合物组比单纯应用亚硝酸钠有更强的增强肝癌细胞迁徙和侵袭的能力。4.亚硝酸钠和氯化铵联合暴露通过ROS/ODC途径增强肝癌细胞迁徙和侵袭能力荧光探针DCFH-DA检测细胞内ROS水平,结果显示:亚硝酸钠组、氯化铵组细胞内ROS荧光强度比对照组稍强;亚硝酸钠和氯化铵混合物组比对照组、亚硝酸钠组、氯化铵组细胞内ROS荧光强度都明显增强。ELISA及Western blotting实验结果显示,与对照组和单纯亚硝酸盐组和氯化铵组相比,混合物组鸟氨酸脱羧酶(ODC)的表达量明显升高。结论:1.亚硝酸盐及铵盐联合暴露比单独亚硝酸盐暴露有更强的促进人肝癌SMMC-7721细胞增殖及侵袭作用。2.亚硝酸盐和铵盐联合暴露可能通过ROS/ODC途径促进肝癌SMMC-7721细胞增殖和侵袭。
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7

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本文编号：1173200