miR-206通过抑制NK1R-FL表达促进乳腺癌生长的机制研究

发布时间：2017-11-23 16:32

  本文关键词：miR-206通过抑制NK1R-FL表达促进乳腺癌生长的机制研究

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【摘要】：研究背景和目的:乳腺癌是女性最常见的癌症,是引起女性癌症相关的发病率和死亡率的主要原因之一。神经肽P物质(Substance P,SP)是速激肽家族的重要成员,通过与其受体NK1R(Neurokinin-1 receptor,NK1R)结合在人类乳腺癌的发生和进展中起着重要的作用。目前为止发现NK1R有两种亚型:全长型受体(full-length NK1R)NK1R-FL和胞内端缺少96个氨基酸残基的截短型受体(truncated NK1R)NK1R-Tr。我们前期研究显示乳腺癌细胞中NK1R-FL的表达与乳腺癌的进展呈负相关,并通过生物学信息学研究发现miR-206可以靶调控人NK1R-FL基因。MicroRNA(miRNA)可以通过与其靶基因mRNA 3’端非编码区(3’Untranslated regions,3’-UTR)以碱基互补配对的方式结合,使靶基因mRNA降解或翻译受到抑制,负向调控靶基因的表达。mi RNA在肿瘤中参与其发生、发展、浸润和转移等多个病理过程。本课题旨在研究乳腺癌中miR-206与NK1R-FL的表达水平之间的关系,进一步,进一步在细胞水平进行验证,并探索miR-206/NK1R-FL信号通路对乳腺癌侵袭、转移和增殖等生物学行为的影响。研究方法:1.组织水平:乳腺癌组织中mi R-206与NK1R-FL的表达分析。收集82对乳腺癌组织及其配对的癌旁组织,提取总RNA,用qRT-PCR检测组织中NK1R-FL和miR-206表达水平;用免疫组织化学方法检测总NK1R和NK1R-FL在乳腺癌组织及其配对的癌旁组织中的表达情况;用qRT-PCR检测乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MCF-7、T47D、SK-BR-3和非肿瘤源性的乳腺上皮系HBL-100中NK1R-FL和mi R-206表达水平;通过Pearson’s相关分析检验miR-206与NK1R-FL mRNA的表达水平相关性。2.靶点预测及相互调控的验证:NK1R-FL的3’-UTR是否存在miR-206的靶向结合位点及相互调控作用。通过TargetScan、PicTar、mi Rnada等生物信息学软件初步预测了NK1R-FL的3’-UTR存在三个miR-206的靶向结合位点并通过荧光素酶报告基因实验进一步验证;然后在乳腺癌细胞系SK-BR-3和非肿瘤源性的乳腺上皮HBL-100中转染miR-206 mimics,在乳腺癌细胞系MDA-MB-231中转染miR-206 inhibitors,westernblot及qrt-pcr检测nk1r-fl的表达水平。3.sp-nk1r信号通路分析:验证mir-206通过靶调控nk1r-fl对乳腺癌细胞ca2+内流及信号通路的改变。通过检测胞内ins(1,4,5)p3浓度的变化来探究mir-206在nk1r-fl依赖细胞内信号传导的过程中的作用;通过观察未转染(nc)组和转染了mir-206mimic组乳腺癌细胞p-erk1/2的改变来探究mir-206通过靶调控nk1r-fl对乳腺癌细胞erk1/2信号通路的作用。4.生物学行为影响研究:验证mir-206-nk1r-fl信号通路对乳腺癌细胞生物学行为的影响。首先在乳腺癌细胞系sk-br-3中转染mir-206mimics/negativecontrol,并通过cck8增殖实验,transwell侵袭和转移及克隆形成实验验证mir-206对乳腺癌细胞增殖、侵袭及克隆形成能力的影响。在乳腺癌细胞系mda-mb-231中转染mir-206inhibitor/inhibitorcontrol,并通过cck8增殖实验,transwell侵袭和转移及克隆形成实验验证mir-206对乳腺癌细胞增殖、侵袭及克隆形成能力的影响。结果:1.乳腺癌组织mir-206与nk1r-fl的表达分析:与癌旁组织相比,乳腺癌组织中nk1r-fl蛋白水平较低,mir-206的表达水平较高,且均与乳腺癌的肿瘤分期分级及有无淋巴结的转移密切相关。与非肿瘤源性人乳腺上皮细胞系hbl-100相比,nk1r-fl在乳腺癌细胞系mda-mb-231、mcf-7、t47d、sk-br-3表达水平较低,mir-206的表达水平则相对较高。且在乳腺癌组织中,mir-206与nk1r-flmrna的表达水平呈负相关关系。2.靶点预测及相互调控的验证:通过生物信息软件预测了在nk1r-fl的3’-utr区存在mir-206的3个靶向结合位点,接着又通过细胞水平的荧光素酶报告基因实验进一步验证mir-206可直接与nk1r-fl的3’-utr区结合对其进行转录调控;在乳腺癌细胞系sk-br-3和非肿瘤源性的乳腺上皮hbl-100中转染mir-206mimics后nk1r-fl的mrna及蛋白水平均下降;在乳腺癌细胞系mda-mb-231中转染了mir-206inhibitors后nk1r-fl的mrna及蛋白水平均升高。3.sp-nk1r信号通路分析:mir-206通过下调nk1r-fl的表达从而使胞内ins(1,4,5)p3的水平降低,从而使ca2+内流的时间延长;mir-206通过下调NK1R-FL的表达从而使胞内ERK1/2的激活时间延长。4.生物学行为影响研究:mi R-206可直接与NK1R-FL的3’-UTR区结合,发挥其转录调控作用,引起NK1R-FL表达水平下降,从而促进肿瘤侵袭、转移、克隆形成和增殖。结论:乳腺癌组织及乳腺癌细胞系中miR-206高表达、NK1R-FL低表达,随乳腺癌进展两者表达呈负相关;miR-206通过靶抑制NK1R-FL表达作用下游信号通路从而促进乳腺癌细胞的侵袭、转移、克隆形成和增殖。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9

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本文编号：1219091