siRNA特异性沉默TLR4基因对人肝癌细胞株的增殖和凋亡的影响以及机制的初步研究

发布时间：2017-11-23 17:00

  本文关键词：siRNA特异性沉默TLR4基因对人肝癌细胞株的增殖和凋亡的影响以及机制的初步研究

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【摘要】：目的si RNA特异性沉默肝癌细胞株的TLR4基因,以研究TLR4基因沉默后对人肝癌细胞株的增殖和凋亡的影响,并初步探讨其作用机制。方法合成TLR4特异性的si RNA 3对(TLR4-si RNA-1、TLR4-si RNA-2、TLR4-si RNA-3),随机si RNA阴性对照1对,FAM标记的si RNA阴性对照1对;取适量的FAM标记的si RNA和lipo2000,使si RNA:lipo2000的比例为0.5:1、1:1、1.5:1、2:1、2.5:1转染入Hep G2细胞,筛选出最佳的转染条件;将合成好的si RNA分别转入人肝癌细胞株Hep G2,运用RT-PCR和Western blot方法筛选出具有最佳沉默效率的si RNA;用具有最佳沉默效率的TLR4 si RNA转染Hep G2,MTT检测转染前后细胞增殖能力的变化;流式细胞术检测转染前后细胞凋亡能力的变化;以Western blot法检测转染前后TLR4下游通路有关蛋白(My D88、TRIF、IRF3、IκBα、p-IκBα、NF-κB、ERK和JNK)的表达。结果用荧光显微镜观察,si RNA:lipo2000比例为1:1时转染效率最高,可达到(90.48±1.27)%;经RT-PCR和Western blot法分析转染前后的TLR4表达含量,TLR4-si RNA-1和TLR4-si RNA-3均发挥TLR4基因沉默效应,TLR4-si RNA 1具有最佳的沉默效率;用具有最佳沉默效率的si RNA-1进行后续实验,将TLR4-si RNA-1转染入Hep G2细胞,MTT检测发现TLR4基因沉默后Hep G2细胞的增殖能力减低,流式检测发现细胞凋亡增加;Western blot检测发现TLR4基因沉默后,其下游的蛋白My D88,TRIF,IRF3,IκBα,JNK和ERK表达量减低,而NF-κB和p-IκBα的表达量增高。结论TLR4-si RNA-1沉默TLR4后,很可能通过抑制ERK和JNK途径和激活NF-κB途径来抑制人肝癌细胞株Hep G2的增殖能力和促进Hep G2细胞的凋亡能力。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7

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本文编号：1219152