Gli2基因沉默对人肝癌细胞系SMMC-7721侵袭转移能力的影响及相关机制

发布时间：2017-11-24 10:04

  本文关键词：Gli2基因沉默对人肝癌细胞系SMMC-7721侵袭转移能力的影响及相关机制

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【摘要】：目的：探讨胶质瘤相关癌基因同源蛋白2(Glioma-associated oncogenehomologue 2,Gli2)对人肝癌细胞系SMMC-7721侵袭转移能力的影响及相关机制。方法：设计3条靶向Gli2基因的shRNA,构建慢病毒载体(pLKD.CMV.GFP.U6 shRNA-Gli2-1,2,3),转染到人肝癌细胞系SMMC-7721。采用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,用流式细胞术检测转染率。利用qRT-PCR、Western blot法筛选出最佳沉默效率的shRNA慢病毒,并检测转染前后Gli2 mRNA口蛋白表达的情况；实验设shRNA-Gli2组(转染shRNA-Gli2的SMMC-7721细胞]、shRNA-NC组(转染Negative control shRNA 的 SMMC-7721细胞)和对照组(未经处理的SMMC-7721细胞)。采用细胞黏附实验检测各组细胞同种及异种黏附率；采用Transwell小室法检测各组细胞迁移、侵袭能力；采用体外血管生成实验检测各组细胞血管生成能力；利用qRT-PCR和Western blot法分析Gli2基因沉默对上皮标志物E-cadherin和间质标志物N-cadherin、MMPs家族中MMP-2及血管生成关键调控因子VEGF-AmRNA和蛋白质表达的影响。结果：1.流式细胞术结果显示,shRNA慢病毒转染率为95%左右。2.筛选出沉默效果最佳的shRNA慢病毒shRNA-Gli2-1,shRNA-Gli2-1组中Gli2 mRNA的表达量为对照组的0.37±0.02倍,Gli2蛋白质的表达量为对照组的0.43±0.05倍。后续实验均以shRNA-Gli2-1转染SMMC-7721细胞,命名为shRNA-Gli2组。3.细胞黏附实验结果显示,shRNA-Gli2组与shRNA-NC组和对照组相比同种黏附率增加(13.71%±1.87 vs 6.35%±1.335.53%±2.01)p0.05),异种黏附率降低(20.57%±1.44 vs 35.64%±2.5833.34%±1.40)(p0.05)。4.细胞迁移实验结果显示,shRNA-Gli2组穿膜细胞数显著少于shRNA-NC组和对照组(40.00±1.46 vs 162.33±12.81 176.67±7.02)p0.05)。5.细胞侵袭实验结果显示,shRNA-Gli2组穿膜细胞数明显少于shRNA-NC组和对照组(18.00±2.66 vs 100.33±3.06106.33±4.16)p0.05)。6.体外血管生成实验结果示,shRNA-Gli2组与shRNA-NC组和对照组相比血管生成能力明显减弱(8.67±2.08 vs 27.33±2.5228.33±3.51)(p0.05)。7. qRT-PCR、Western blot法结果显示,shRNA-Gli2组与shRNA-NC组和对照组相比E-cadherin表达显著增高而N-cadherin、MMP-2、 VEGF-A表达明显降低(p0.05)。结论：沉默Gli2的表达能够抑制人肝癌细胞系SMMC-7721侵袭转移能力,其机制可能与E-cadherin的表达上调和N-cadherin、MMP-2(?)VEGF-A的表达下调有关。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7

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本文编号：1221859