结直肠癌无线粒体DNA细胞株的建立及其生物学行为的观察

发布时间：2017-12-21 06:29

  本文关键词：结直肠癌无线粒体DNA细胞株的建立及其生物学行为的观察　出处：《成都医学院》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：结直肠癌(CRC)在发达国家中肿瘤发病率排名第四,死亡率居第二。我国CRC的发病率和死亡率均以每年3%-5%的速度递增,且发病人群有明显的年轻化趋势。结直肠癌早期症状不典型,诊断率很低,尤其是结直肠癌的术后复发转移,成为导致结直肠癌患者预后不理想甚至死亡的主要原因。因此探索结直肠癌的发生发展及侵袭转移的机制,寻找更为有效的检测指标进行早期诊断,以及探索新的有效治疗方法有着十分重要的意义。目的流行病学研究表明结直肠癌细胞线粒体DNA(mt DNA)拷贝数变异与患者预后具有显著相关性,但因缺乏相关体外细胞模型导致其细胞生物学效应及具体分子机制尚不明确。因此建立结直肠癌ρ0细胞株(无mt DNA),并初步研究拷贝数变异对细胞生物学行为的改变及其作用机制,为寻找结直肠癌新的治疗方法提供研究平台。方法(1)在含有丙酮酸、尿苷及不同浓度溴化乙锭的培养基中培养大肠癌细胞株SW480、HCT 116、HCT-8,以不加溴化乙锭的细胞为对照,利用实时定量PCR技术监测不同处理组mt DNA拷贝数的变化;(2)光镜下观察观察结直肠癌ρ0细胞形态的变化;(3)ρ0细胞及其亲本细胞经mito-tracker染色后用激光共聚焦显微镜观察线粒体数量的变化;(4)细胞计数法绘制构建ρ0细胞及其亲本细胞的生长曲线;(5)利用流式细胞仪检测上述3对细胞的细胞周期变化;(6)以Transwell侵袭实验计数穿膜细胞数来比较上述3对细胞的侵袭能力;(7)流式细胞仪检测这上述3对细胞活性氧(ROS)的生成。结果(1)SW480细胞用50 ng/m L EB处理25代后,再以100 ng/m L EB处理14代可成功构建SW480ρ0细胞株;HCT116细胞加用EB 100 ng/m L培养32代,继续用EB 200 ng/m L培养10代,再用EB 500 ng/m L培养3代,可成功获得HCT 116ρ0细胞株;HCT-8细胞用200 ng/m L EB培养24代,可成功获得HCT-8ρ0细胞株。(2)在光镜下观察,3株ρ0细胞均较其亲本细胞变大变长。(3)Mito-tracker染色后经激光共聚焦显微镜观察ρ0细胞线粒体均较其亲本细胞线粒体的个数增多。(4)SW480ρ0、HCT 116ρ0、HCT-8ρ0生长速度明显慢于其亲本细胞,呈较为平缓的生长曲线。(5)在细胞周期的各个阶段里,3株ρ0细胞与其亲本细胞的百分比相似,差异均无统计学意义(P0.05)。(6)Transwell侵袭实验结果显示,3株ρ0细胞的穿膜细胞数均较其亲本细胞显著减少(P0.01)。(7)流式细胞仪检测细胞内ROS生成显示,3株ρ0细胞胞内ROS生成均较其亲本细胞显著减少(P0.01)。结论利用EB处理法可成功构建结直肠癌ρ0细胞株,但不同细胞构建方法不尽相同。此种方法构建的无mt DNA细胞可在含尿嘧啶、丙酮酸和10%胎牛血清的培养基中连续传代、稳定生长。mt DNA拷贝数的降低可显著影响结直肠癌细胞形态及其线粒体数量。结直肠癌线粒体电子传递链功能缺失细胞抑制细胞周期进程,增殖、侵袭能力明显减弱,但是并不影响细胞周期各个阶段的百分比,可能与细胞内ROS的生成减少有关。
【学位授予单位】：成都医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.34

【引证文献】

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1 石菊芳;张s，

本文编号：1315076