GCS通过影响BCL-2的表达介导结肠癌细胞的多药耐药

发布时间：2017-12-21 15:01

  本文关键词：GCS通过影响BCL-2的表达介导结肠癌细胞的多药耐药　出处：《郑州大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：背景与目的在现阶段,化疗依然是治疗终末期肿瘤的主要手段,而肿瘤细胞多药耐药的形成是导致化疗失败的直接原因,导致预后不良。多药耐药(MDR)是指肿瘤细胞在对某一种化疗药物产生耐药后,对其他化学作用原理不同、结构各异的抗肿瘤药物产生交叉耐药的现象。神经酰胺在抑制肿瘤细胞增殖、促进凋亡方面起着重要作用,而葡萄糖神经酰胺合成酶(GCS)可以催化神经酰胺糖基化生成葡萄糖神经酰胺(Glc Cer),从而可以逃避神经酰胺介导的肿瘤凋亡。越来越多的证据表明,肿瘤细胞多药耐药的形成与细胞内葡萄糖神经酰胺合成酶水平升高有着密切的关系。细胞中ERK蛋白的高表达可以促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达上调,作用于细胞凋亡的下游共同通路,发挥抗凋亡作用,Bcl-2的抗凋亡作用已被证实参与肿瘤细胞多药耐药的形成,有文献报道,白血病耐药细胞中存在GCS与Bcl-2的共同高表达[1]。但目前GCS与Bcl-2的关系及作用机制在结直肠癌中报道甚少。本研究旨在通过检测结肠癌敏感株细胞HCT-8、耐药细胞HCT-8/VCR及加入GCS抑制剂PPMP后,各组细胞中GCS、Bcl-2及ERK的表达情况,探讨其相互关系及可能的作用机制。方法1细胞株的培养1)HCT-8组:结肠癌敏感细胞HCT-8在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液(含青霉素、链霉素各100 U/m L)中常规培养,培养条件为37℃、CO2体积分数为5%、饱和湿度。至少培养2周后,取对数期生长良好的细胞进行实验。2)HCT-8/VCR组:结肠癌耐药细胞HCT-8/VCR在含1.0μg/ml VCR的培养基中培养,以维持其耐药性。实验在脱药培养2周,取对数期生长良好的细胞进行。3)HCT-8/VCR+PPMP组:HCT-8/VCR细胞株脱药培养后,继续在含有20μmol/L PPMP的培养基中培养48h后进行实验。2蛋白质印迹法(Western Blot)收集HCT-8组、HCT-8/VCR组和HCT-8/VCR+PPMP组细胞,提取总蛋白,Western Blot检测各组细胞GCS、Bcl-2及ERK蛋白的表达情况。3荧光定量PCR法(RT-q PCR)收集HCT-8组、HCT-8/VCR组和HCT-8/VCR+PPMP组的细胞,提取RNA,RT-q PCR检测各组细胞GCS、Bcl-2及ERK基因的表达情况。结果1.结肠癌敏感细胞HCT-8及耐药细胞HCT-8/VCR中均有GCS和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,耐药细胞株中GCS的表达高于敏感细胞株,差异显著(P0.05);并且Bcl-2在耐药株中的表达也明显高于敏感株细胞(P0.05),与GCS具有一致性。2.HCT-8/VCR组与HCT-8/VCR+PPMP组相比,加入GCS抑制剂PPMP后,明显抑制了GCS的表达(P0.05);同时,在HCT-8/VCR+PPMP组抗凋亡蛋白Bcl-2与ERK蛋白的表达较HCT-8/VCR组下降(P0.05)。3.RT-q PCR检测HCT-8/VCR组与HCT-8组目的基因,结果显示:耐药组细胞中GCS、Bcl-2及ERK基因都高于其亲本细胞组,且差异显著(P0.05)。4.HCT-8/VCR组和HCT-8/VCR+PPMP组相比,加入抑制剂组的细胞内GCS m RNA的表达量明显低于HCT-8/VCR组(P0.05);加入抑制剂PPMP后,细胞内Bcl-2和ERK基因的表达也较耐药细胞组明显下调(P0.05)。结论1.在结肠癌细胞HCT-8及其耐药细胞HCT-8/VCR中,抗凋亡蛋白Bcl-2与GCS的表达具有一致性。2.GCS通过影响抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,从而介导结肠癌细胞多药耐药,这一过程是通过ERK信号通路完成的。3.在细胞中加入GCS抑制剂PPMP,可以明显抑制GCS的表达;进而使Bcl-2基因及蛋白的表达水平下调,可逆转细胞耐药。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.3

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本文编号：1316117