SENP1对骨髓瘤细胞生物学特性的影响及机制研究

发布时间：2017-12-22 15:42

本文关键词：SENP1对骨髓瘤细胞生物学特性的影响及机制研究　出处：《安徽医科大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：多发性骨髓瘤依然是具有较高死亡率和复发率的.不可治愈的疾病。进一步从分子和基因水平研究其信号通路和调控将提供新的治疗靶点。SUMO蛋白酶1(SENP1)是一个调控蛋白SUMO化的重要蛋白酶,该酶影响细胞周期、增殖和分化。但SENP1介导的蛋白去SUMO化与骨髓瘤发病和治疗中的作用并不清楚。目的：(1)对SENP1在多发性骨髓瘤细胞中的表达水平进行研究(2)检测SENP1敲除对骨髓瘤细胞凋亡、增殖、细胞周期以及集落形成等细胞功能的影响(3)对SENP1与骨髓瘤中重要异常信号通路相互作用做进一步的机制探讨方法：(1)以健康捐献者骨髓单个核细胞做参照,使用real-time PCR、免疫印迹检测SENP1在3种骨髓瘤细胞系以及6例骨髓瘤病人CD138+细胞中的水平(2)使用含有shRNA的慢病毒感染骨髓瘤细胞系48h后,使用流式细胞仪以及荧光显微镜检测感染效率,并同时使用QPCR,免疫印迹的方法确认敲除效率(3)以感染对照病毒的骨髓瘤细胞做为参照,使用慢病毒shRNA敲除SENP1后利用CKK8试剂盒检测不同时间点骨髓瘤细胞系的增殖情况(4)感染慢病毒shRNA 48h后,以感染对照病毒细胞做为参照,流式细胞术检测SENP1敲除后骨髓瘤细胞凋亡与细胞周期的变化(4)免疫印迹确认IL-6对SENP1的诱导作用、SENP1与NF-κB通路的相互作用以及SENP1敲除对IL-6激活NF-κB的影响,并使用EMSA进一步探究SENP1敲除对NF-κB转录活性的作用。结果：(1)与健康捐献者骨髓单个核细胞比较,MM细胞中SENP1在RNA和蛋白水平表达增高,差异具有统计学意义,而IL-6能通过STAT3对SENP1产生诱导作用,且呈时间和浓度依赖性。(2)与感染对照病毒骨髓瘤细胞系比较发现,在感染慢病毒shRNAl 48h时,骨髓瘤细胞系XG-7与RPMI8226中SENP1在RNA分别下降至45±1%与87±0.1%,shRNA2则下降至19%±2%与23±1%,差异具有统计学意义在蛋白水平中,SENP1的表达也受到了明显的抑制。(3)敲除SENP1后,使用流式细胞术检测XG-7、RPMI8226的凋亡变化后发现shRNA2能够使凋亡细胞增加了40%左右,差异具有统计学意义。使用CCK8方法检测SENP1敲除后XG-7、RPM8226的增殖变化后发现骨髓瘤细胞系的增殖几乎被完全抑制。在敲除SENP1后48h使用流式细胞仪检测细胞周期后发现XG-7中凋亡明显增加,而RPMI8226 GO/G1期比例明显增加。SENP1敲除后使用硼替佐米处理后发现硼替佐米的杀伤作用被增加。(3)进一步机制探讨发现在这一过程中,STAT3位于SENP1的上游。SENP1的敲除同时还能够抑制NF-kB通路P65、IKBα的磷酸化,并阻断了NF-κB通路抑制因子IKB α的降解,与此同时,骨髓瘤细胞中SUMO-2结合总蛋白的水平明显升高,可以解释SENP1的敲除引起的NF-kB的抑制。使用IL-6处理SENP1敲除后的骨髓瘤细胞发现IL-6引起的P65的磷酸化被抑制,SENP1敲除同时还可以导致NF-kB转录活性的降低。,使用硼替佐米抑制NF-kB通路后发现SENP1的表达下降,预示了SENP1与NF-kB的相互作用呈环状。结论：SENP1在骨髓瘤细胞系和原代细胞中高表达,SENP1的敲除不仅促进骨髓瘤细胞系的凋亡,还能抑制增殖并对细胞周期产生影响,而硼替佐米对骨髓瘤细胞系的杀伤作用也得到明显的增加。SENP1的敲除对骨髓瘤细胞系的杀伤与它抑制了NF-κB通路、并部分阻断了IL-6的作用有关。本研究为骨髓瘤的治疗提供了一个新的治疗靶点,为未来的体内实验及进一步的临床研究奠定了基础。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R733.3

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