S100P在结肠癌转移中的作用及其上游转录调控机制研究

发布时间：2018-01-28 01:09

  本文关键词： 结肠癌 S100P 转移 生存预后 转录因子 上皮间质变　出处：《南方医科大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：虽然结肠癌诊疗技术取得了长足的实质性的进展,但是伴有转移或是无法根治性切除结肠癌患者的长期生存率并无法令人满意。结肠癌作为全球常见恶性肿瘤之一,每年近120万人被诊断为新发病例,并且每年约60万人死于结肠癌。结肠癌成为了全球第四致死性恶性肿瘤。其中肿瘤复发及转移是造成目前状况的主要原因。因此,探寻结肠癌发生发展过程中转移相关关键分子；寻找肿瘤转移诊断生物分子标记物,为肿瘤个性化治疗提供参考依据；阐明肿瘤发生发展及转移过程中的相关分子调控机制,为肿瘤治疗靶点提供理论依据。是当今肿瘤研究的热点,也是提高人类对恶性肿瘤的认识,并改善肿瘤患者生存及预后的必经之路。肿瘤的发生发展及转移是一个多阶段,多步骤,并由多种基因及信号通路共同参与的复杂过程。目前针对胃肠道肿瘤远处转移的主要学说有：1、直接侵袭：侵袭性较强的肿瘤细胞突破基底膜直接蔓延到邻近部位；2、淋巴转移：肿瘤细胞进入淋巴循环内,通过淋巴管由近及远转移到各级淋巴结。除此之外,肿瘤直接转移至较远淋巴结的跳跃式转移也时常可见；淋巴结的肿瘤侵袭情况将直接影响患者的肿瘤分期,对病情及预后的评估极为重要；3、血行转移：肿瘤细胞代谢较正常细胞显著加大,这促进了瘤体内部新生血管的形成。肿瘤细胞可脱离瘤体进入血管,并随血流转移至远隔部位如肝、骨、肺、脑等处,形成转移瘤灶；4、种植：对于胃肠道肿瘤往往起源于粘膜层,随着病情的进展,肿瘤最终可突破浆膜层,肿瘤细胞脱落并种植到腹腔内其他器官表面,如腹膜或卵巢上。大量研究证实,发生转移的肿瘤组织与未发生转移的肿瘤组织存在大量差异性表达基因。在肿瘤发生发展过程中,由于这些差异性表达的转移相关基因导致了,肿瘤细胞的代谢、运动能力、粘附性及外分泌蛋白出现了改变,从而导致了肿瘤细胞较高的侵袭性与转移性。在前期研究中。我们以伴随远处转移的结肠癌手术标本为研究对象,利用基因芯片技术,将伴随远处转移的结肠癌组织与未发生远处转移的结肠癌组织进行了基因表达差异的比对。最终筛选出差异表达基因217个。其中转移性结肠癌中表达上升90个,表达下降127个。通过生物信息学分析并利用real-time quantitative polymerase chain reaction (Q-PCR)及免疫组化验证,我们发现了S100P、PRDX1、SLPI这3个结直肠肿瘤转移相关候选基因。其中候选基因S100P隶属于具有EF手型结构的钙结合蛋白S100家族,参与钙离子依赖性信号传导。S100P最早发现于人类胎盘中。S100P是广泛分布在正常人体组织,包括心脏、脑、肝脏、肺、骨髓和外周血白细胞。在亚细胞层面,在多种细胞的核和细胞质中均可观测到S100P的表达。在细胞内S100P通过激活ezrn、CasyBP/SIP等蛋白调控一系列信号通路。此外,S100P还可外分泌进入细胞间质,调节本体细胞及周边细胞功能。细胞外的S100P可与细胞膜表面蛋白RAGE结合,进而使得Erkl/2磷酸化,激活MAPK/ERK通路。研究证实,S100P涉及肿瘤细胞生长、运动、粘附、凋亡等过程。为了进一步分析S100P在结直肠肿瘤发生发展中所起的作用,以及S100P在诊断及预后预测方面的临床价值,阐明S100P在肿瘤转移过程中所起的作用机制。本研究分析比较125例肿瘤发展不同阶段结肠腺癌的临床手术标本中S100P的表达差异,结合临床数据进行统计学分析。并利用S100P敲低稳转结肠癌细胞株分析S100P在结肠癌发生发展过程中所发挥的作用及其分子机制。1、免疫组化检测人结肠腺癌手术标本S100P表达情况腺癌是消化道肿瘤中最为常见多发的病理类型。为了更好探寻S100P表达量与结直肠进展及预后的关系,我们利用免疫组化技术对125例不同临床分期的结肠腺癌手术标本及其配对手术切缘正常结肠组织进行分析。发现肿瘤组织中S100P表达量显著高于正常组织。利用统计学检验分析肿瘤组织中S100P表达量与临床数据的相关性后,我们发现s100P的表达高低与患者术前血中CEA(χ2=9.704,P=0.002)、CA19-9(χ2=5.051,P=0.025),肿瘤大小(χ2=4.098,P=0.043),N分期(χ2=1.033,P=0.309),M分期(χ2=36.863,p0.001),TNM分期(χ2=13.528,P0.001)存在相关性。在收集患者术后随访信息后,对S100P表达情况与患者生存时间进行生存分析后,我们发现S100P高表达的患者预后显著低于S100P低表达的患者(χ2=30.080,P0.001)。通过建立多因素COX风险预测模型,对S100P表达量与不同临床数据进行比对分析后,结果显示S100P(hazards ratiio,HR=2.697,P0.001)、TNM分期(HR=3.678,P0.001)可被视为患者预后的独立预测因子。S100P在肿瘤中的高表达预示着肿瘤较高的转移能力以及不良预后。为了进一步验证S100P基因在结肠癌组织中的表达情况,我们利用Q-PCR和Western blot技术对临床结肠癌手术标本中S100P的表达量进行了检测,结果显示,在结肠癌组织中S100P基因的mRNA表达量约为正常组织中的3倍之多(t=7.704,P0.001),结肠癌组织中S100P蛋白表达量亦是显著高于正常结直肠组织(t=4.739,P=0.018)。实验结果与免疫组化所观察到的现象一致,一定程度上证明了S100P在结肠癌发生发展的过程中扮演着一定的角色,S100P是结肠癌相关蛋白。也为下一步阐明S100P在结肠癌中所起作用及其作用机制奠定了重要理论依据。2、S100P在结肠癌中所发挥的作用为探寻S100P在结肠癌中的作用机制,选取合适的体外研究对象,我们对6种不同结肠癌细胞系：LS174T、SW480、HCT116、SW620、LOVO、DLD-1的S100P基因及蛋白表达量进行了检测,结果显示LS174T、HCT116、DLD-1相对于SW480、SW620、LOVO为S100P高表达细胞株。结合细胞状态及其生长情况,最终我们选取了S100P高表达的LS174T、HCT116细胞株作为我们的研究对象。肿瘤相关蛋白由于其在肿瘤组织中的表达差异,所引起其所在调控网络中其他蛋白及信号通路的变化,进而导致肿瘤的发展。人为干扰肿瘤相关蛋白的差异性表达,观察肿瘤相关蛋白表达量恢复后,细胞功能较之前的变化,以推断该蛋白中肿瘤发生发展过程中所起作用。这是目前研究肿瘤相关蛋白的一致观点。本研究利用siRNA干扰技术,设计针对S100P mRNA不同的siRNA,通过Q-PCR和Western blot检测,筛选S100P干扰效率最高的siRNA,并根据其设计表达S100P-siRNA及绿色荧光(GFP)的慢病毒。利用表达S100P-siRNA的慢病毒转入结肠癌细胞株LS174T、HCT116,构建S100P敲低的稳转结肠癌细胞株LS174T-S100P-KD、HCT116-S100P-KD。利用S100P敲低的稳转结肠癌细胞株,在体外对细胞的侵袭性、迁移性进行了检测。通过对裸鼠的皮下成瘤及腹腔内注射,构建动物肿瘤模型及腹腔内播散模型。观察S100P表达在体内对结肠癌细胞成瘤性及转移性的影响。通过体内体外功能实验,我们发现敲低S100P后,HCT116、LS174T细胞株的迁移能力(HCT116:t=5.868,P=0.004；LS174T:t=4.806,P=0.009)、侵袭性(HCT116:t=5.126,P=0.007:LS174T:t=2.933,P=0.043)与成瘤性(HCT116:t=2:794,P=0.049；LS174T:t=3.445,P=0.026)均显著下降,在裸鼠腹腔内播散种植病灶也较对照组减少。3、S100P促进结肠癌转移相关分子机制的初步探讨研究表明,S100P可外分泌至细胞间质,再与细胞膜表面蛋白RAGE结合,继而激活下游MAPK/ERK信号通路,使得Erkl/2磷酸化,从而影响细胞的生物学功能。另有报道证实,MAPK/ERK信号通路与肿瘤细胞的上皮间质转变(EMT)存在密切联系。而EMT是肿瘤细胞侵袭转移过程中的重要机制之一,也是当今肿瘤分子机制研究的热门。在研究过程中,S100P与肿瘤的侵袭转移能力密切相关。据此,我们提出假设：S100P通过与细胞膜蛋白RAGE结合,激活Erk1/2磷酸化,进而促进肿瘤细胞的EMT过程,从而影响结肠癌的侵袭与转移。利用构建的S100P敲低的稳转结肠癌细胞株LS174T-S100P-KD、 HCT116-S100P-KD,通过Western blot检测S100P敲低的稳转结肠癌细胞株及阴性对照细胞株中S100P、RAGE、Erkl/2、p-Erkl/2、上皮细胞标记物E-cadherin、间质细胞标记物N-cadherin、Vimentin、Sn ail的表达差异。在敲低S100P表达量后,相比未敲低S100P的阴性对照组,细胞株中RAGE及磷酸化Erk1/2的表达量随之下降,肿瘤细胞株的上皮细胞标记物E-cadherin表达量也出现下降,而间质细胞标记物N-cadherin、Vimentin、Snail的表达量则出现了上升。初步证实了,S100P激活RAGE/ERK信号通路,促进了结肠癌细胞的EMT过程。4、筛选及验证S100P上游调控转录因子基因的表达受到体内多种方式的调控,其中基因表达调控主要发生于转录过程中,调控过程围绕着转录过程,如转录前调控、转录调控以及转录后调控。真核生物基因表达转录需要多种蛋白因子协助,其中转录因子(transcription factor, TF)是一群能与DNA特定序列特异性结合,从而促进或是抑制目的基因表达的蛋白质分子,是转录调控中的关键因子。经验证S100P基因在结肠癌中相比正常组织的高表达,是否存在异常表达的转录因子导致了S100P基因的过表达。为进一步探索S100P在结肠癌中过表达的原因,我们对S100P上游调控转录因子进行了探索及预测。在对S100P基因启动子进行检索后,利用JASPAR转录因子预测软件(http://jaspar.genereg.net/cgi-bin/jaspar_db.pl)对S100P基因可能的转录因子及其转录因子结合位点进行了预测。在众多预测结果中,我们挑取评分较高的候选转录因子进行文献调研并检测其在结肠癌组织与正常结直肠组织中的表达情况。最终,我们将目标锁定在SOX9蛋白上。SOX (sex determining region Y box)家族是具有HMG盒(high mobility groupbox)的一类与性腺发育有关的核转录因子,包括A～J10个亚家族。研究发现,SOX家族与癌症发生有密切联系,包括黑色素瘤、胃癌、髓母细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌等。SOX9最早是从一种性别反转畸形的遗传性疾病患者中克隆得到。近来,SOX9与肿瘤的关系也开始受到关注。为验证SOX9为S100P的转录因子,我们首先检测SOX9与S100P在相同结肠癌组织及细胞系中的表达情况。实验结果证明,SOX9与S100P在结肠癌组织中均为表达升高,在高表达S100P的结肠癌细胞株中SOX9也相应的高表达,两者存在一定相关性。接着我们利用凝胶电泳迁移实验(EMSA)、定量染色质免疫共沉淀(Q-ChIP)技术(HCT116:t=3.871,P=0.018:LS174T:t=2.889,P=0.016)、双荧光素酶报告检测系统检测LS174T、HCT116细胞株中SOX9与S100P基因的特异性结合情况。我们利用siRNA技术特异性干扰LS174T、HCT116细胞株SOX9表达后,观察S100P基因表达的变化情况。在SOX9被敲低后,S100P基因及蛋白表达也随之出现下降。证明了SOX9是S100P基因的转录因子,并且SOX9表达可以调控S100P基因的表达。此外,我们还运用免疫荧光共聚焦技术观察SOX9在LS174T、HCT116细胞株中表达定位情况,SOX9在细胞浆及细胞核中均有表达,这也从侧面反映了SOX9作为转录因子的可能性。5、SOX9与S100P在结肠癌中表达情况的相关性分析及其在肿瘤进展中所起的作用SOX9作为S100P转录因子调控S100P转录表达,SOX9在结肠癌中的表达情况应影响S100P的表达。为了验证这一理论设想,我们利用组织芯片免疫组化技术分析90例人结肠腺癌手术标本中SOX9及S100P的表达情况,并利用统计学方法进行线性回归分析。结果显示在结肠癌手术标本中,SOX9与S100P的表达量存在线性回归(R2=0.782,F=315.459,P0.001),SOX9高表达的病例中存在S100P高表达的现象,两者存在线性关系。此外,高表达SOX9及高表达S100P的病例预后显著差于低表达组。我们还构建了SOX9干扰细胞株、SOX9过表达细胞株、SOX9过表达及S100P干扰细胞株以及各自的阴性对照。通过对SOX9不同表达量细胞株进行Westernblot检测,我们发现结肠癌细胞中高表达的SOX9通过转录调控S100P,导致S100P表达量的升高,过表达的S100P进而激活MAPK/ERK信号通路,促进肿瘤EMT的过程,从而影响肿瘤的侵袭与转移能力。在过表达SOX9的同时,若敲低S100P的表达,则可逆转这个过程,MAPK/ERK信号通路及EMT过程仍处于抑制状态,肿瘤细胞的侵袭(t=6.309,P=0.001)和转移(t=4.769,P=0.003)能力也较SOX9过表达组大为减弱。裸鼠动物模型进一步证实了体外细胞实验结果。结论：1、S100P在结肠癌组织中相比正常结直肠组织高表达。在结肠腺癌中,S100P的表达量与患者血液中CEA、CA19-9的水平、瘤体大小、淋巴结转移、远处转移及TNM临床分期相关。S100P表达量、远处转移情况可被视为患者生存预后的独立预测因子。S100P高表达预示着肿瘤较强的转移能力及不良预后。2、S100P促进结肠癌细胞株的侵袭、转移及成瘤能力。3、S100P通过激活RAGE/ERK信号通路,继而促进结肠癌的上皮间质转变过程,从而影响肿瘤细胞的生物学功能。4、SOX9是S100P基因的转录因子,在结肠癌组织中高表达,是导致S100P结肠癌中高表达的原因之一。通过干扰SOX9表达,可以影响S100P的表达,SOX9对S100P基因的表达具有调控作用。5、SOX9与S100P在人结肠组织中表达满足线性回归,SOX9高表达的病例也存在S100P的高表达。高表达的SOX9及S100P预示着不良的预后。SOX9转录调控S100P的表达,表达升高的S100P激活MAPK/ERK信号通路,促进EMT进展,影响结肠癌的侵袭及转移。S100P在SOX9促进结肠癌的侵袭与转移的过程中是必不可少的关键蛋白。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.35
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本文编号：1469338