MicroRNA-22-3p通过下调靶基因Sp1抑制肝癌细胞的增殖、转移和侵袭

发布时间：2018-01-28 11:16

本文关键词： miR-22-3p Sp1 肝癌增殖迁移侵袭　出处：《广西医科大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景和目的:肝细胞癌(下文中简称肝癌或HCC)是全世界最常见且恶性程度比较高的肿瘤之一,其发病率在恶性肿瘤中排在第五位,其死亡率位排第三位。肝癌的综合治疗手段有手术切除、肝动脉化疗栓塞术、肝移植、射频消融治疗等。手术治疗是肝癌治疗的首选方法。肝移植虽然可以获得较满意的效果,但是,由于供体肝的缺乏,肝移植术的开展受到了很大限制。肝动脉化疗栓塞术及射频消融治疗等方法具有相对比较好的疗效,然而由于肝癌起病隐匿,所以大部分患者诊断的时候已属晚期,只有30%~40%的患者可以接受根治性的治疗,而对于大部分进展期的肝癌患者不得不接受姑息性的治疗。由于各种治疗手段的局限性、疾病本身的复发与转移、合并基础肝病的严重程度及治疗过程中的肝功衰竭等各个方面,仍然限制了各种治疗手段疗效的提高,与人们的预期存在较大差异,故迫切需要结合肝癌的发病机制研究,进一步研发新的治疗方法,目的为改善肝癌患者的预后和提高肝癌患者的生存质量。Micro RNA(mi RNA),是一组天然的非编码的小分子RNA,长度约为二十一到二十五个核苷酸,mi RNA可特异性抑制或降解靶m RNA的翻译从而调节靶基因的表达。最近的研究表明,mi RNA在调节多种人体内发生的生理或者病理过程中发挥关键作用,这些过程包括新陈代谢,细胞分化和肿瘤的发生发展。mi RNA在人类肿瘤中可以根据靶基因的不同而作为调节肿瘤的发生发展的致癌基因或抑癌基因。mi RNA-22-3p,前体为pre-mi-22,是在Dicer酶切后形成的产物。到目前为止,有关mir-22-3p在肝细胞癌中的功能研究及mir-22-3p的靶基因仍未有报导。因此,mir-22-3p在肝癌的发生发展过程中的功能作用及其机制值得我们深入去研究。在本研究中,我们拟通过实时定量q RT-PCR检测mi R-22-3p在肝癌的组织和细胞系中的表达特点;利用化学合成的方法增强内源性mi RNA的功能,通过MTT、细胞周期、细胞迁移和侵袭、裸鼠皮下成瘤等实验方法来研究mi R-22-3p对于肝癌的增殖及转移能力的影响;根据生物信息学预测结果,通过实时定量技术、蛋白质电泳、突光素酶报告实验确定mi R-22-3p的靶基因。目的为明确mi R-22-3p在肝癌增殖及转移的过程中的功能作用,期望从分子水平探讨肝细胞癌的发生及转移的机理,从而为肝癌的临床诊断及治疗提供分子标记物和目标。方法:1.肝癌中mi R-22-3p的表达特性的鉴定我们用q RT-PCR检测了20例HCC及其对应癌旁组织,以及10例正常肝组织中mi R-22-3p的表达情况。检测mi R-22-3p在HL-7702、Hep G2、7721、Huh-7、Hep3B这5种细胞株中的表达。2.mi R-22-3p对于肝癌体内和体外生物学特性的影响(1)利用化学合成的方法,将mimics-mi R-22-3p转染至Hep G2细胞中,然后我们采用MTT细胞增殖实验、细胞周期实验、划痕实验以及Transwell侵袭实验检测mi R-22-3p对于体外肝癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力的影响。(2)利用化学合成的方法,将antagomirago-mi R-22-3p转染至Hep G2细胞中,将antagomirago-mi R-22-3p转染组细胞注射进裸鼠皮下,然后进一步观察mi R-22-3p对于Hep G2在裸鼠皮下的成瘤能力的影响。3.mi R-22-3p靶基因的预测和鉴定(1)应用生物信息学预测软件micro RNA、Target Scan、Pictar预测mi R-22-3p调控的靶基因.(2)利用化学合成的方法,将mimics-mi R-22-3p及inhibitor-mi R-22-3p转染至Hep G2细胞中,利用Western Blot检测mimics-mi R-22-3p及inhibitor-mi R-22-3p组及其对应NC组细胞中候选靶基因Sp1的表达情况,初步鉴定其是否为mi R-22-3p的靶基因。(3)利用化学合成方法沉默Sp1(si RNA-Sp1),将si RNA-Sp1转染进Hep G2细胞中,利用荧光定量RT-PCR检测si RNA-Sp1、si RNA-NC以及NC组的Hep G2细胞中mi R-22-3p的表达情况,以说明Sp1是否影响mi R-22-3p的表达。(4)利用q RT-PCR检测mi R-22-3p的候选靶基因Sp1在肝癌细胞株Hep G2以及正常肝细胞株HL-7702中的表达情况;利用RNA干扰技术沉默Sp1(si RNA-Sp1),将si RNA-Sp1转染进Hep G2细胞中,然后采用MTT细胞增殖实验、划痕实验以及Transwell侵袭实验检测Sp1对体外Hep G2细胞的增殖、迁移以及侵袭能力的影响。(5)利用双萤光素酶报告基因系统来检测mi R-22-3p与Sp1之间的相互作用来鉴定Sp1是否为mi R-22-3p的靶基因。结果:1.肝癌中mi R-22-3p的表达特性的鉴定(1)肝癌组织、癌旁组织及正常组织中mi R-22-3p的表达情况我们用q RT-PCR检测了20例HCC及其对应癌旁组织,以及10例正常肝组织中mi R-22-3p的表达情况,结果显示:在HCC组织中,mi R-22-3p的表达水平显著低于其相对应的癌旁组织(P0.01)。虽然在癌旁组织中mir-22-3p的表达水平低于在正常肝组织中的表达,但是该差异没有统计学意义(P0.05)。(2)q RT-PCR检测mi R-22-3p在五种细胞系中的表达情况q RT-PCR结果发现:以正常细胞系HL-7702为对照,在四种肝癌细胞系中mi R-22-3p的表达均低于在正常细胞系HL-7702中的表达(P0.01),并且在Hep G2肝癌细胞中表达最低。结果提示:mi R-22-3p在肝癌中的低表达是中的一种很普遍的现象,mi R-22-3p的低表达可能与肝癌的的发生发展相关。2.mi R-22-3p对于肝癌体内和体外生物学特性的影响a.mi R-22-3p对于肝癌体外生物学特性的影响(1)将mimics-mi R-22-3p及NC转染到Hep G2细胞中,并通过q RT-PCR检测其转染效率。结果显示为:转染mimics-mi R-22-3p后,Hep G2细胞中mi R-22-3p的表达水平明显上调,结果提示干扰效果显著(P0.001)。(2)采用MTT法检测转染mimics-mi R-22-3p及其NC后的Hep G2细胞,检测Hep G2细胞的体外增殖能力,然后绘制细胞抑制曲线。结果显示mimics-mi R-22-3p组细胞的增殖能力明显较mimics-NC组受到抑制(P0.05)。结果提示:过表达mi R-22-3p能抑制肝癌细胞的体外增殖能力。(3)将转染mimics-mi R-22-3p及对应NC组细胞进行流式细胞术检测肝癌细胞周期。结果显示:与NC组及空白对照组相比,mimics-mi R-22-3p组细胞G2期的细胞含量百分比明显增加(P0.05),说明mi R-22-3p可能使肝癌细胞在G2期受到了阻滞。同时,我们没有检测到过表达mi R-22-3p后肝癌细胞的调亡有明显改变,因此我们推测mi R-22-3p主耍通过诱导细胞周期阻滞在G2期,从而抑制细胞的生长。(4)Mimics-mi R-22-3p转染Hep G2细胞后划痕,在0h和24h拍照,结果显示:,mimics-mi R-22-3p转染组细胞的迁移能力(24h划痕宽度/0h划痕宽度:mimics-mi R-22-3p组:0.711±0.032,Mimics-NC组:0.327±0.029,空白对照组:0.294±0.041)与mimics-NC组和空白对照组相比有明显差异(P0.05),过表达mi R-22-3p后Hep G2的细胞迁移能力有明显的减弱。可见,上调mi R-22-3p后对细胞迁移能力有明显抑制作用。(5)Transwell侵袭实验结果显示:Mimics-mi R-22-3p转染组细胞的穿膜细胞数明显少于mimics-NC组和空白对照组,Mimics-mi R-22-3p感染Hep G2胞后,Mimics-NC组透膜细胞数为(129.2±5.5)/视野,空白对照组透膜细胞数为(119.6±4.4)/视野,Mimics-mi R-22-3p组透膜细胞数为(69.7±6.7)/视野,Mimics-mi R-22-3p转染组细胞侵袭能力明显低于imics-NC组和空白对照组细胞(P0.05)。结果提示:过表达mi R-22-3p可明显抑制Hep G2细胞体外侵袭能力。b.mi R-22-3p对于肝癌体内生物学特性的影响采用裸鼠皮下成瘤实验进一步检测mi R-22-3p对Hep G2细胞在体内增殖能力的影响。裸鼠成瘤的统计结果显示antagomiragomir-mi R-22-3转染细胞注射组的裸鼠成瘤能力较antagomirago-NC组和空白对照组显著增高。3.mi R-22-3p靶基因的预测及鉴定(1)应用生物信息学预测软件micro RNA、Target Scan、Pictar预测mi R-22-3p调控的靶基因。初步候选Bcl2,CCND1,Sp1成为预测结果中的靶基因,其中Sp1可能性最大。(2)Western Blot检测Mimics-mi R-22-3p、Inhibitor-mi R-22-3p及其对应NC转染细胞后Bcl2,CCND1,Sp1蛋白的表达。结果显示:与Mimics-NC相比,Mimics-mi R-22-3p转染组Hep G2细胞中Sp1蛋白的表达明显减少(P0.05)。与Inhibitor-NC相比,Inhibitor-mi R-22-3p转染组Hep G2细胞中Sp1蛋白的表达明显升高(P0.05)。说明了Sp1极有可能是mi R-22-3p的靶基因。(3)已明确mi R-22-3p和Sp1相互之间为逆向作用的关系后,为了明确是mi R-22-3p作用于Sp1还是Sp1作用于mi R-22-3p,我们把Sp1沉默后用q RT-PCR检测mi R-22-3p的表达,结果显示:mi R-22-3p在si RNA-Sp1组,si RNA-NC组以及空白对照组的细胞之间的表达量没有统计学差异(P0.05)。说明Sp1并不影响mi R-22-3p的表达。(4)q RT-PCR结果发现:Sp1在Hep G2细胞株中的表达水平高于正常细胞株HL-7702(P0.01)。结果提示:Sp1高表达在肝癌中是一种普遍的现象,Sp1的高表达可能与肝癌的发生发展相关。(5)将si RNA-Sp1及si RNA-Sp1-NC转染到Hep G2细胞中,并通过q RT-PCR检测si RNA-Sp1、si RNA-NC及空白对照组的转染效率。结果显示:转染si RNA-Sp1后Hep G2细胞中Sp1表达水平明显下调,提示沉默现象明显(P0.001)。(6)MTT细胞增殖实验检测si RNA-Sp1组、si RNA-NC组中Hep G2细胞的在体外增殖能力,然后绘制细胞抑制曲线。si RNA-Sp1组细胞相对于si RNA-NC组中Hep G2细胞的增殖能力明显受到下调(P0.05)。结果提示:抑制Sp1的表达能抑制肝癌细胞的体外增殖能力。(7)si RNA-Sp1转染Hep G2细胞后进行划痕,在0h和24h时间点拍照,结果显示:,si RNA-Sp1组细胞迁移能力(24h划痕宽度/0h划痕宽度:si RNA-Sp1组0.688±0.037,si RNA-NC组0.394±0.026,空白对照组0.311±0.032)明显比si RNA-NC组和空白对照组低(P0.05),沉默Sp1后细胞迁移能力明显减弱。结果提示:下调Sp1后对体外Hep G2细胞的迁移能力有显著的抑制作用。(8)Transwell侵袭实验结果显示:si RNA-Sp1转染组细胞的穿膜细胞数明显少于si RNA-NC和空白对照组,si RNA-Sp1感染Hep G2胞后,si RNA-NC组透膜细胞数为(97.2±6.3)/视野,空白对照组透膜细胞数为(102±4.6)/视野,si RNA-Sp1组透膜细胞数为(47.2±5.5)/视野,si RNA-Sp1组细胞的侵袭能力显著低于si RNA-NC组及空白对照组细胞(P0.05)。结果提示:抑制Sp1的表达能明显抑制Hep G2细胞的体外侵袭能力。(9)双萤光素酶系统结果显示:3'UTR-NC+mi RNA组和3'UTR+mi RNA相比,有显著性差异(P0.05),说明mi R-22-3p与靶基因Sp1的3'UTR的结合,抑制其表达。结论:1.mi R-22-3p在肝癌细胞中低表达是一种普遍现象,过表达mi R-22-3p可明显抑制肝癌细胞的增殖、侵袭以及转移能力。2.mi R-22-3p可能通过调节其靶基因Sp1的表达,从而抑制肝癌细胞增殖、侵袭及转移。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7

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